GAD65基因特异siRNA的构建和功能检测

孔令菊　周　静　赵　刚　姚素艳　郑德宇(辽宁医学院病理生理学教研室，辽宁　锦州　121001)

GAD65基因特异siRNA的构建和功能检测

孔令菊周静赵刚姚素艳郑德宇
(辽宁医学院病理生理学教研室，辽宁锦州121001)

〔摘要〕目的构建GAD65基因特异的siRNA并检测体外功能。方法应用RT-PCR方法克隆大鼠GAD65基因、测序、重组病毒包装检测体外功能。针对GAD65基因的编码区，设计3条siRNA片段及一条对照片段，将其分别亚克隆于siRNA的慢病毒表达载体并小量包装获得病毒颗粒(LV-GFP-siRNA-rGAD65) ;用siRNA病毒颗粒感染GAD65过表达的293细胞，检测GAD65表达情况，从中筛选出高效特异的siRNA。大量包装特异的siRNA病毒颗粒，在体外感染培养的大脑皮质细胞，在体内注射到SD大鼠的苍白球内侧部，检测rGAD65的表达水平，观察siRNA的功能。结果应用RT-PCR方法克隆rGAD65基因，其序列与GenBank中的基因序列几乎一致(99.72％)，包装病毒后在293细胞中过表达。筛选出针对rGAD65的高效特异的siRNA，在GAD65基因的沉默效率可达到66％。在体外、体内分别应用Western印迹检测感染了LV-GFP-siRNA3-rGAD65的大脑皮质细胞和定点注射了LV-GFP-siRNA3-rGAD65的大鼠GPi。结论成功克隆rGAD65基因，设计、筛选出高效特异的siRNA，并证明这种siRNA在体内和体外均能有效地沉默rGAD65的表达。

〔关键词〕谷氨酸脱羧酶;小干扰RNA;基因沉默

第一作者:孔令菊(1985-)，女，主要从事神经退行性病变的研究。

帕金森病(PD)是常见于中老年人的神经退行性病变，主要病理特征是中脑黑质多巴胺(DA)能神经元变性缺失。黑质对大脑皮质-基底节-丘脑-皮质环路起重要的调节作用〔1〕。基底节环路的主要输出核团黑质网状部(SNr)和苍白球内侧部(GPi)的神经递质为γ-氨基丁酸(GABA)，谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(GAD)的催化下脱羧生成GABA。有人将GAD的反义RNA定点注入GPi，结果显示具有改善PD动物模型运动症状的作用〔2〕。但反义核酸需要大量核酸且效果不持久，不具有放大效应。受此启发，如果应用RNAi技术沉默GPi和SNr的GAD基因的表达，减少GPi和SNr神经末稍释放GABA的量，使丘脑腹前核(VA) /丘脑腹外侧核(VL)过度抑制情况得到缓解，可能会重新建立一种大脑基底神经环路的平衡，在理论上应具有较好的改善PD动物模型运动症状和恢复大脑基底神经环路平衡的作用。为此，我们克隆大鼠GAD基因，针对GAD基因的编码区，设计siRNA并将其克隆于siRNA表达载体;并筛选高效特异的siRNA，在体内外分别检测siRNA的作用。

1　材料和方法

1.1实验材料包装细胞293T细胞株(中科院上海细胞所)、大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen)、胰蛋白酶(Invitrogen)、限制性内切酶(Fermentas)、T4 DNA连接酶(NEB)、质粒DNA提取试剂盒(Axygen)、rGAD65单克隆抗体(Sigma)、制备感受态试剂盒(Biosciences)、凝胶回收试剂盒(Qiagen公司)。

1.2实验方法

1.2.1rAAV2-rGAD65的构建、包装参考GenBank登录的大鼠谷氨酸脱羧酶(rat GAD，rGAD) mRNA的序列(NM-000818) 和T载体的酶切位点进行包括全部CDS区设计上、下游引物，上游引物: 5＇-GCCCCGGGATGGCATCTCCGGGCTCTGGCTTTTG-3＇，在上游引物中设计5＇插入SmaⅠ酶切位点。下游引物: 5＇-GCGGTACCCTATAAATCTT GTCCAAGGCGTTC-3＇。在下游引物3＇设计插入KpnI酶切位点。应用RT-PCR的方法获得rGAD65基因，经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切rGAD65和T载体，将基因克隆到T载体上，经酶切鉴定正确的质粒送生物公司测序，结果与GenBank上的rGAD65 cDNA序列进行比对。将序列正确的rGAD65基因亚克隆到AAV载体上并进行rAAV-rGAD65重组病毒颗粒的包装。检测病毒的滴度，备用。应用10 IPO的浓度感染293细胞，筛选后获得稳定表达GAD65的293细胞。

1.2.2特异siRNA的设计、构建根据rGAD65基因序列，共设计3条siRNA分子及一条对照分子，通过BLAST验证该序列对于任何基因无干扰效果，设计引物和酶切位点，其中loop结构选用了TTCAAGAGA。并将获得的正确的siRNA序列亚克隆于siRNA表达载体LV-GFP-CTB上，分别计为LV-GFP-siRNA1-GAD65、LV-GFP-siRNA2-GAD65、LV-GFP-siRNA3-GAD65和LV-GFP-siRNAneg-GAD65，与包装载体pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染293T细胞，小量包装病毒。用获得的重组干扰病毒分别转染GAD65过表达的293细胞，检测GAD65表达情况，从中筛选出高效特异的siRNA。

1.2.3siRNA的包装、沉默效率的病毒滴度的检测选择干扰效率高的序列，应用慢病毒包装系统进行大量包装，包装后的病毒经高速离心和冷冻干燥浓缩近1 000倍后进行病毒滴度的检测。应用原始病毒，依次进行10倍稀释，从10－4直至10－10，应用不同稀释倍数的病毒液感染A549细胞，根据A549荧光细胞数计算病毒的滴度。

1.2.4siRNA的功能检测体外培养大脑皮质细胞，分别应用LV-GFP-siRNA3-GAD65和LV-GFP-siRNAneg-GAD65病毒颗粒10 IPO感染培养的大脑皮质细胞，应用Western印迹的方法检测在感染1 w后大脑皮质细胞中GAD65基因的表达水平。将105个病毒颗粒(LV-GFP-siRNA3-GAD65、LV-GFP-siRNAneg-GAD65和等体积的PBS)定点注射到SD大鼠苍白球的内侧部，1 w后，大鼠断颈处死，在冰上迅速剥出大脑，在解剖显微镜下分离出双侧的苍白球外侧部，应用Western印迹的方法检测GAD65的表达水平。

2　结果

2.1rGAD65基因克隆应用RT-PCR方法从大鼠大脑皮质中克隆出rGAD65基因，基因进行3次测序拼接序列与Gen-Bank中的序列几乎一致(1 818/1 823)，符合率达到99.72％。只有5个碱基与原碱基不同，但并没有引起氨基酸序列的改变，也没有造成错义突变，说明应用RT-PCR方法成功克隆出了rGAD65基因。

2.2rGAD65基因siRNA的设计、构建根据rGAD65的基因序列，设计了三条小干扰序列(siRNAn-rGAD65)，同时设计一条无关序列Negative(siRNAneg-rGAD65)用于对照组实验，通过BLAST验证该序列对于任何基因无干扰效果，设计引物和酶切位点，克隆并测序，贮存序列正确的克隆产物。3个实验序列依次是:序列1: 3＇-GCATTGGTTGACATCAACACTCTCTTGAATTCTGTTGATGTCAACCAATCTGCTTTTTT-5＇;序列2: 3＇-GCATTTCTGCAAGATGTAATGCTCTCTTGAATTCCATTACATCTTGCAGAAATGCTTTTTT-5＇;序列3: 3＇-GCAGCAGATTGGTTGACATCACTCTCTTGAATTCTGATGTCAACCAATCTGCTGCTTTTTT-5＇。首先小量逆转录病毒病毒包装，用rGAD65预先感染293细胞，再用siRNA感染293细胞，可见红色荧光明显减少，经Real time PCR的结果显示，序列3干扰序列干扰效率可达66％。见图1。

图1　GAD65基因感染HEK293细胞后，再次应用siRNA-GAD65(negative)感染293细胞

2.3siRNA的大量包装及滴度检测按慢病毒包装试剂盒的说明书将各种包装质粒按一定的比例混合，共转染包装细胞293T，2 d后收集上清和细胞，获得重组病毒载体LV-GFP-siRNA3-GAD65。并经冷冻干燥浓缩收集到的病毒。经滴度测定，病毒的滴度为4.8×108/ml。分装，－80℃冷冻保存备用。

2.4LV-GFP-siRNA3-GAD65的功能检测

2.4.1体外检测转染LV-GFP-siRNA3-GAD65的细胞的GAD65的表达明显低于阴性对照组(转染LV-GFP-siRNAneg-GAD65)和正常细胞组，但对照组和正常细胞组则没有明显的区别(图2)。

图2　GAD65在大脑皮质中的表达

2.4.2体内检测注射LV-GFP-siRNA3-GAD65的苍白球内侧部中GAD65蛋白表达明显低于无关对照(LV-GFP-siRNA3neg-GAD65)、PBS和正常的脑组织，且无关对照、PBS组及正常脑组织三者间没有明显的差异。见图3。

图3　GAD65在苍白球内侧部的表达

3　讨论

GAD65主要分布于神经元轴突及以细胞膜结合酶的形式存在〔3〕，STN定点注射GAD65能减弱PD模型动物行为异常和保护黑质DA神经〔4〕，可推测GAD65产生的GABA起到传统观念的神经递质的作用〔5〕，所以本实验所选用的研究对象为GAD65。如果能在体内抑制或下调GAD65的功能，则可能会减少GABA能神经元在兴奋过程中释放GABA的量，达到缓解PD运动症状的作用。

短小干扰双链RNA(siRNA)能降解具有与其序列相同的单链mRNA分子，从而高效、特异地沉默靶基因的表达〔6〕，在细胞内发挥基因敲除的作用〔7〕。受此启发，应用RNAi技术沉默GPi和SNr的GAD基因的表达，减少GPi和SNr神经末稍释放GABA的量，可能会重新建立一种大脑基底神经环路的平衡。本实验将克隆所得的GAD65 cDNA的CDS全长亚克隆入慢病毒中，酶切鉴定正确。应用siRNA的设计软件设计并合成了siRNA，经筛选后获得了针对rGAD65高效特异的小干扰RNA。并且体内和体外均验证了小干扰RNA的功能，能沉默rGAD65基因，下调了大鼠GAD65蛋白的表达，说明针对rGAD65的siRNA已经设计、构建并包装成功，可以用于后续的体内实验。

4　参考文献

1Jankovic J.Parkinson’s disease: clinical features and diagnosis〔J〕．J Neurol Neurosurq Psychiatry，2008; 79(4) : 368-76.

2Schneider JS.Wade TV.Experimental parkinsonism is associated with increased pallidal GAD gene expression and is reversed by site-directed antisense gene therapy〔J〕．Movement Disord，2003; 18(1) : 32-40.

3 Martin DL，Barke KE.Are GAD65 and GAD67 associated with specific pools of GABA in brain〔J〕? Perspect Dev Neurobiol，1998; 5(2-3) : 119-29.

4 Kim J，Yoon YS，Lee H，et al.AAV-GAD gene for rat models of neuropathic pain and Parkinson＇s disease〔J〕．Acta Neurochir Suppl.2008; 101: 99-105.

5 Ji F，Kanbara N，Obata K.GABA and histogenesis in fetal and neonatal mouse brain lacking both the isoforms of glutamic acid decarboxylase 〔J〕．Neurosci Res，1999; 33(3) : 187-94.

6陈东平，张志坚，吴秀丽，等.大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及其在骨髓间质干细胞中的表达〔J〕．生物工程学报，2009; 25 (2) : 299-305.

7 Feng LR，Maguire-Zeiss KA.Gene therapy in Parkinson＇s disease: rationale and current status〔J〕．CNS Drugs，2010; 24(3) : 177-92.

〔2013-07-18修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者:郑德宇(1973-)，男，博士，教授，主要从事神经退行性病变的研究。

〔中图分类号〕R742.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4465-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.020