右美托咪定预先给药对大鼠全脑缺血再灌注损伤的影响

贾建丽 蔡劲松 戚翔 杨幼明 闫静 李雪 徐雪

缺血性脑血管疾病是一种发生于中老年的常见病 和多发病，其发病率、病死率、致残率和复发率均很高，并且有上升趋势和年轻化趋势。如何防治脑缺血再灌注损伤，减轻脑缺血再灌注损伤，寻求一种合适有效的治疗药物及措施，一直是临床各科室所关注的问题。对于既往存在缺血性脑血管疾病的患者实施手术，麻醉过程中的脑保护问题尤为重要，可以最大程度地减少围术期脑血管意外情况的发生。右美托咪定(DEX)是一种新型高效高选择性的α2肾上腺素能受体激动剂，有镇静、抗焦虑、镇痛、抑制交感神经、明显减少麻醉药的用量和稳定血流动力学等特点，且呼吸抑制作用小［1］。因其独特的药理特性在临床麻醉的特殊治疗领域:唤醒麻醉［2］、困难气道［3］、儿童用药［4］等方面显示出来极大的优越性，基础研究已证实DEX对脑缺血再灌注损伤具有一定保护作用［5，6］，但预先给药是否具有脑保护作用，笔者未见报道。本研究以此为切入点，研究不同剂量DEX预先给药是否具有脑保护作用，且是否具有剂量依赖性。旨在进一步为临床用药提供有力的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雄性SD大鼠40只，月龄3～3.5个月，体重 280～350 g，合格证号: 1303097，由河北医科大学实验动物中心提供。实验前，所有动物均在安静清洁的实验室喂养2～3 d以适应实验室环境，室温23℃，12 h间隔照明，以标准大鼠营养饲料喂养，任其自由进食水。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备:10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉成功后，采用Pulsinelli-Brierley等［7］的四血管闭塞改良法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠清醒后放回单独的鼠笼饲养。动物存活24 h后，不行麻醉将其仰卧位固定于鼠板上，颈部正中切口，长约3 cm，钝性分离颈部肌肉，暴露双侧颈总动脉，用1～0的细丝线穿过颈总动脉备用。尾静脉穿刺置管，接微量泵以备输入DEX或0.9%氯化钠溶液。采用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，造成动物全脑缺血，15 min后松开动脉夹，恢复脑血流灌注，模型制备成功的标志为血流阻断后1 min内大鼠的意识丧失，翻正反射及对光反射消失，瞳孔散大，颜色苍白，呼吸加快，在整个缺血期内维持不变。恢复血流灌注后，瞳孔颜色立即变成鲜红色，瞳孔缩小至正常水平，意识渐渐恢复，翻正反射恢复，并在整个再灌注期内维持不变。S组:假手术组，仅接受手术而不遭受全脑缺血打击，术中予持续静脉泵注0.9%氯化钠溶液2 h，输注速度2 ml/h。C组:缺血再灌注对照组，全脑缺血15 min后再灌注30 min，在全脑缺血前2 h予以持续静脉泵注0.9%氯化钠溶液2 h，输注速度2 ml/h。D1组:DEX低剂量组，全脑缺血前2 h予以DEX首次剂量(6 μg/kg)10 min内静脉输注，剩余剂量以0.05 μg·kg-1·min-1持续静脉泵注2 h，输注速度2 ml/h(DEX用0.9%氯化钠溶液稀释)。D2组:DEX中剂量组，全脑缺血前2 h予以DEX首次剂量(60 μg/kg)10 min内静脉输注，剩余剂量以0.5 μg·kg-1·min-1持续静脉泵注2 h，输注速度2 ml/h(DEX用0.9%氯化钠溶液稀释)。

1.2.2 全脑缺血模型的建立:采用Pulsinelli-Brierley等的四血管闭塞改良法建立大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠清醒后放回单独的鼠笼饲养。

1.2.3 脑组织含水量测定:模型制备成功，大鼠再灌注30 min后，每组随机取4只，立即断头取脑，在冰浴中剥出大脑，左侧大脑行脑组织含水量测定。4组实验动物在缺血再灌注30 min后，立即断头取脑，取左侧大脑用万分之一的电子分析天平称湿重后，置入110°C恒温干燥箱烤干至恒重(2次称重差别＜0.2 mg)后，用同一电子天平再精确称干脑组织重量，并按照eliot干湿重法计算脑组织含水量，以百分率表示。脑含水量(%)=(湿重-干重)/湿重× 100%。

1.2.4 病理检测:模型制备成功，大鼠再灌注30 min后，每组随机取4只，先快速输入0.9%氯化钠溶液200～300 ml进行心脏灌注，继而以4℃ 4%的多聚甲醛固定液(pH值7.4，0.1 mol/L PB配置)300～400 ml进行心脏灌注，30～60 min完成灌注。开颅取脑，左右两侧大脑分别置入4℃4%的多聚甲醛中和4%的戊二醛中备病理、电镜检测。

1.2.5 光镜标本采集:拟行光镜检测标本，于视交叉后缘每隔2 mm平行作3个冠状切面，取2片2 mm厚的脑组织于4%多聚甲醛固定液中再固定24 h，经常规梯度脱水、透明、浸蜡包埋，切片厚为5 μm。行苏木紫-伊红染色。

1.2.6 透射电子显微镜观察:拟行电镜检测标本，冰盘上迅速选取海马CA1区组织，按“快、小、轻、准”的原则取材，以锋利刀片于视交叉后4 mm冠状切开右侧脑组织，切取海马CA1区标本3～4块，大小为1 mm ×1 mm×1 mm。经固定、清洗、梯度脱水、浸透、包埋、聚合后，超薄切片机切厚约40 nm的切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染色电子染色后应用JEM-1230(日本)透射电镜拍片，观察神经元、星形胶质细胞、线粒体、高尔基体等超微结构的变化。

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料正态分布数据以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，并进行方差齐性检验，如方差不齐则采用秩和检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠体重和月龄比较 4组大鼠的体重、月龄差异均无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 4组大鼠体重和月龄比较 n=10，±s

表1 4组大鼠体重和月龄比较 n=10，±s

组别 体重(g) 月龄(月) S组311±24 3.28±0.20 C组 314±24 3.25±0.16 D1组 325±20 3.32±0.15 D2组316±23 3.29±0.22

2.2 DEX预先给药对大鼠全脑缺血再灌注损伤后脑水含量的影响 脑组织水含量的测定结果表明，与S组比较，C组、D1组、D2组大鼠脑组织含水量明显升高(P均＜0.05);与C组比较，D1组、D2组大鼠脑组织含水量差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 4组大鼠缺血再灌注后脑组织含水量变化n=5，%，±s

表2 4组大鼠缺血再灌注后脑组织含水量变化n=5，%，±s

注:与S组比较，*P＜0.05

组别 脑组织含水量S组79.11±0.26 C组 80.15±0.61* D1组 80.04±0.46* D2组 79.87±0.77*

2.3 DEX预先给药对大鼠全脑缺血再灌注神经病理观察 S组海马CA1区锥体细胞层神经元有3～4层，排列整齐紧密，细胞界限清晰，胞核呈圆形或椭圆形，淡染，占整个细胞的2/3，有1～2个核仁，呈圆形，深染;C组海马CA1区锥体细胞排列散乱，大量锥体细胞核水肿，透明，少数细胞体积变小成三角形，核浓缩深染，结构消失;D1组、D2组较C组脑组织病变轻，多数锥体细胞存活，固缩神经元数量及神经元缺失明显减少。

2.4 DEX预先给药对大鼠全脑缺血再灌注后4组海马CA1区神经元超微结构的影响

2.4.1 S组:神经元细胞核呈圆形或椭圆形，核膜清楚，核仁清晰;胞质内细胞器正常，线粒体形态不一，线粒体嵴清晰规则，高尔基体囊泡排列规则;毛细血管内皮细胞及星形细胞正常。

2.4.2 C组:神经细胞周围可见明显水肿带，胞质水肿，线粒体电子密度增高，肿胀，嵴断裂、减少、或消失，高尔基体囊泡扩张;星形细胞明显肿胀;毛细血管内皮细胞肿胀，管周明显水肿。见图1。

图1 C组超微结构变

2.4.3 D1组:神经细胞周围仍可见水肿，但较C组减轻;线粒体电子密度增高，肿胀，高尔基体囊泡扩张;星形细胞肿胀较C组减轻;毛细血管周围可见水肿。见图2。

图2 D1组超微结构变化

2.4.4 D2组:神经细胞周围仍可见水肿，但较C组减轻;线粒体电子密度增高，略肿胀，高尔基体囊泡略扩张;星形细胞略肿胀;毛细血管周围水肿。见图3。

3 讨论

大鼠全脑缺血再灌注动物模型的建立方法有很多种，常见的有两血管阻断伴低血压模型、沙土鼠两血管阻断法、Pulsinelli等［7］的四血管阻断法、颈动脉分流动物模型等。其中，四血管阻断法全脑缺血再灌注动物模型在国内使用较多，它的解剖学基础在于大鼠腹侧脊髓动脉有一定向脑干的返支，四血管阻断期间可以维持脑干的血液供应，使大鼠在一定时间内能够存活下来。其优点是缺血效果确切，操作相对简单，实验重复性好，可较好的模拟临床上因心脏骤停、严重低血压休克、心肺脑复苏等所致的缺血性脑损伤过程，这是本研究采用此模型的依据。

图3 D2组超微结构变化

血脑屏障将中枢神经系统和血液系统隔离开来，防止血浆中对脑组织有毒性作用的物质进入脑内，维持中枢神经系统的功能正常。血脑屏障破坏后导致血液中毒性物质进入脑内，离子平衡失调引起脑水肿，通常脑组织含水量增加的多少，反映脑组织水肿程度［8］。脑缺血再灌注后继发的脑水肿，会降低脑的灌注压，损害毛细血管和增大氧气从血液弥散到细胞的距离，从而进一步加重原有的脑缺血病变。脑组织含水量测定是反映脑水肿的重要指标:脑水肿时脑组织含水量增加，脑含水量的高低直接反映脑水肿的严重程度，同时也可反映脑细胞的损伤程度。本实验显示于对照组C组比较，D1、D2组脑组织含水量有降低趋势，但未显示出统计学差异，可能与标本量较少有关。

大鼠短暂性全脑缺血模型以前脑缺血为主，前脑缺血的病理性变化可累及大脑皮层、纹状体、杏仁核、丘脑、下丘脑、海马、中脑、嗅球等区域，病理性检测结果是评价缺血性脑损伤的金标准。海马是缺血性脑损伤最易感的组织之一，海马在低倍镜下呈“C”形，分为CA1、CA2、CA3、CA4四个区，短暂性全脑缺血模型以CA1区对缺血最为敏感，CA3区对缺血有较好的耐受。本实验主要对CA1区超微结构进行观察。研究结果表明S组CA1区有3～4层椎体细胞，排列紧密整齐，高倍镜下可见椎体细胞核大而圆、淡染，有1～2个核仁，超微结构下观察，S组椎体细胞核大而圆，核仁明显，染色质密度均一，线粒体、高尔基体等细胞器丰富，星形细胞正常。C组全脑缺血15 min后再灌注30 min，CA1区损伤严重，失去正常结构，椎体细胞排列散乱，大量椎体细胞变性，核固缩，椎体细胞明显减少，仅残存极少量形态相对完好的神经元。超微结构下可见神经细胞周围水肿明显，胞质水肿，线粒体电子密度增高，肿胀，嵴断裂、减少、甚至消失，高尔基体囊泡扩张，毛细血管内皮细胞肿胀，管周明显水肿，星形细胞明显肿胀。D1组神经细胞周围肿胀、星形细胞肿胀较C组减轻。D2组线粒体虽电子密度仍显增高，但肿胀较C组减轻。通过超微结构变化可以看出全脑缺血再灌注后海马CA1区对缺血刺激敏感的神经元、星形胶质细胞、细胞器在对照组显示出明显的损伤改变，细胞器中以线粒体的改变最为明显，表现为电子密度增高、嵴断裂或缺失。分析原因可能是由于缺血改变势必会导致缺氧性改变，而线粒体由于其特殊的结构和功能最易受缺氧的影响，即受到活性氧的攻击。线粒体DNA(mtDNA)分布于线粒体内膜周围，临近活性氧产生的部位，且由于其周围没有组织蛋白的保护，即缺乏相关的DNA修复酶，极易受到活性氧的攻击而损伤［9］。正常情况下细胞内同时存在有效的抗氧化防御机制，如呼吸链的自我净化、各种抗氧化酶、DNA修复系统等，可以及时清除线粒体有氧代谢过程中产生活性氧，使其保持在极低水平，因此很少受到它的伤害。但在一些病理状态下，如缺血再灌注损伤发生后活性氧生成过多过快或者机体抗氧化功能的降低，使线粒体及细胞发生受损，表现为线粒体肿胀、畸形、空泡形成等，说明线粒体受到了较严重的损害。D1、D2组可见线粒体嵴的破坏程度减轻、正常线粒体增多，可见经右美托咪定预先给药后，上述超微结构中细胞水肿减轻、线粒体肿胀减轻，血管源性水肿和细胞毒性水肿得到缓解产生了从而产生了一定的保护作用。

综上所述，全脑缺血再灌注损伤大鼠，低剂量组和中剂量组右美托咪定预先给药均可产生有一定的脑保护作用，表现脑组织水肿减轻，超微结构细胞器肿胀减轻但2组之间未显示出显著差异。

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