子宫内膜异位症患者组织及血清巨噬细胞移动抑制因子、血管内皮生长因子及受体的表达及意义

杨青春

子宫内膜异位症(endometriosis，EM)是一种育龄期女性常见的妇科良性疾病，该病发病率逐年升高且具有侵袭、转移等恶性行为，患者主要症状有进行性痛经、腰骶痛、月经异常及不孕等，严重影响患者生活质量［1，2］。目前，EM的发病机制还未完全阐明，有研究显示异位子宫内膜的黏附、侵袭和血管形成是该病病灶种植和增殖的关键和必备条件［3］。本研究探讨EM患者组织及血清巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR1、VEGFR2)的表达及与病情严重程度的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2015年1月我院妇产科收治的需经腹腔镜手术治疗的EM患者45例。所有患者有腰骶痛、进行性痛经、人工流产或不孕史，盆腔检查可触及子宫后壁或宫骶韧带的触痛结节，B超检查证实为子宫内膜异位囊肿，术中可见紫蓝色粘连结节等，术后经病理确诊为EM。排除标准:(1)急慢性感染者;(2)恶性肿瘤患者;(3)合并子宫腺肌症、子宫肌瘤患者;(4)合并严重心脑血管疾病及肝肾疾病患者;(5)近期服用过性激素类药物者。参照美国生育协会制定的R-AFS分期标准，其中Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期13例，Ⅳ期10例。选取同期于我院体检的健康女性30例为对照组。2组年龄、腰围、体重指数(BMI)、FSH/LH、孕次、产次等一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。见表1。

表1 2组一般资料比较 ±s

表1 2组一般资料比较 ±s

组别 年龄(岁) 腰围(m) BMI(kg/m2)FSH/LH对照组(n=30)34.12±5.25 0.75±0.09 24.33±4.22 1.43±0.22观察组(n=45)33.31±5.57 0.79±0.13 23.68±4.01 1.49±0.24

1.2 主要试剂 兔抗人MIF、VEGF单克隆抗体、VEGFR1、VEGFR2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。免疫组化SP试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。ELISA试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 免疫组织化学SP法:标本用10%甲醛固定，石蜡包埋，切成4 μm厚的石蜡切片，65℃烘烤，脱蜡，采用免疫组织化学染色SP法测定MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达，严格按照试剂盒说明书操作，用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照:3%H2O237℃孵育10 min灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤;微波修复抗原，PBS洗涤;10%山羊血清封闭，室温孵育10 min;用1∶50稀释的二抗4℃过夜孵育，PBS冲洗;加生物素标记的抗人IgG抗体室温孵育30 min，PBS冲洗;辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素室温孵育30 min，PBS冲洗;DAB显色;苏木素染色，封片，光镜观察。

1.3.2 微血管密度(MVD)计数:将被CD34单克隆抗体棕色染色的单个内皮细胞或一簇细胞丛作为一个微血管。采用CD34标记的MVD(CD34-MVD)法计数内皮细胞MVD值:100倍光镜下观察整个切片，选取3个最有代表性的组织切片，排除存在出血和边缘反应区的切片。低倍镜下选出每张切片中3个血管密度最高区(热区)，400倍光镜下计数热区中被抗CD105抗体染成棕色的单个或成簇微血管数，取3个视野的平均值即为该例切片的MVD值。

1.3.3 酶联免疫吸附试验(ELISA):抽取患者空腹静脉血10 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存备用。采用ELISA法测定患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达水平，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.4 统计学分析 应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，相关性采用Sperman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者组织MIF、VEGFV、EGFR1、VEGFR2的表达比较 观察组MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达均为阳性，阳性表达率与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 2组患者组织MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2阳性表达比较例(%)

2.2 2组患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达比较 观察组MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表达水平与对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 2组患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达比较±s

表3 2组患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达比较±s

注:与对照组比较，*P＜0.05

组别 MIF(ng/ml) VEGF(pg/ml) VEGFR1(pg/ml)VEGFR2(pg/ml)对照组(n=30)7.1±1.2 92.1±12.9 130.2±21.2 225.3±31.6观察组(n=45) 19.5±3.2* 185.0±25.2* 226.6±33.6* 384.6±46.2*

2.3 2组患者组织MVD计数比较 观察组MVD计数显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表4。

表4 2组患者组织MVD计数比较 个/Hp，±s

表4 2组患者组织MVD计数比较 个/Hp，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05

组别MVD对照组(n=30)15.7±2.4观察组(n=45) 35.3±5.7*

2.4 EM患者组织MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达与MVD值的相关性 Sperman相关分析显示，EM患者组织MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达与MVD值均呈正相关性(r值分别为0.762、0.814、0.876、0.798，P＜0.05)。

2.5 EM患者组织不同R-AFS临床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2阳性表达比较 不同R-AFS临床分期患者组织MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2阳性表达率均不同，R-AFS临床分期越高者 MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2阳性表达率越高(P＜0.05)。见表5。

2.6 EM患者组织MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达与R-AFS临床分期的相关性 Sperman相关分析显示，EM患者组织MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2阳性表达率与病变严重程度呈正相关性(P＜0.05)。见表6。

表5 EM患者组织不同R-AFS临床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2阳性表达比较 例(%)

表6EM患者组织MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达与R-AFS临床分期的相关性

2.7 EM患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达与R-AFS临床分期的相关性 不同R-AFS临床分期患者血清中MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达水平均不同，R-AFS临床分期越高者MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达水平越高(P＜0.05)。Sperman相关分析显示，子宫内膜异位症患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达水平与病变严重程度呈正相关性(P＜0.05)。见表7、8。

3 讨论

EM是子宫内膜样组织出现在子宫外其他部位，是好发于育龄期女性的常见、慢性妇科疾病，该病具有侵袭性强、易复发的特点，是不孕症的主要发病原因之一，对患者生育能力和生活质量均造成严重影响［1，2］。目前，EM的发病机制尚不清楚，研究显示EM的发生发展与血管形成、炎性反应、激素水平、细胞免疫或体液免疫等因素有关［3］。

表7 EM患者血清不同R-AFS临床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达比较 ±s

表7 EM患者血清不同R-AFS临床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达比较 ±s

注:与Ⅰ期比较，*P＜0.05;与Ⅱ期比较，#P＜0.05;与Ⅲ期比较，△P＜0.05

类别 MIF(ng/ml) VEGF(pg/ml) VEGFR1(pg/ml) VEGFR2(pg/ml)Ⅰ期(n=10) 6.04±0.93 97.65±10.34 126.35±18.21 230.21±32.28Ⅱ期(n=12 16.10±2.52* 161.23±22.48* 201.59±29.77* 324.16±44.32*Ⅲ期(n=13) 22.73±3.41*# 210.12±30.23*# 263.61±37.55*# 432.65±51.38*#Ⅳ期(n=10) 32.95±3.91*#△ 270.95±42.44*#△ 314.95±48.75*#△ 551.32±59.45*#△

表8 子宫内膜异位症患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达与R-AFS临床分期的相关性

巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是活化的T细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等分泌的一种免疫炎性因子，在糖皮质激素、脂多糖、TNF-α等细胞因子刺激下可诱导释放，参与调节机体免疫应答、炎性反应、细胞增殖及分化、恶性肿瘤形成等多种生理和病理过程［4］。临床研究表明MIF在正常组织和血清仅微弱表达，而EM患者在位内膜组织MIF表达增高［5，6］。Pan等［7］研究发现 MIF能够增强基质金属蛋白酶(MMPs)降解细胞外基质的能力，从而促进异位内膜细胞的侵袭和植入。有研究发现MIF通过上调血管生成相关基因的表达促进血管生成过程，并通过下调p53基因表达抑制EM患者异位内膜的凋亡［8，9］。以上研究表明MIF从多个环节参与EM的发生及进展，与EM发生密切相关。

研究显示新生血管形成在EM病理过程中具有至关重要的作用，为异位子宫内膜的移行、种植及增殖提供了必要条件［10］。血管内皮生长因子(VEGF)是迄今发现作用最强的促血管生成因子，与内皮细胞上的受体(VEGFR1和VEGFR2)具有高度亲和力，结合后通过促进血管内皮细胞有丝分裂发挥促血管生成作用。研究显示，血管内皮细胞VEGF通过自分泌方式上调自身表达VEGFR1和VEGFR2，同时VEGFR1和VEGFR2又可正反馈调节VEGF蛋白表达，从而对血管内皮细胞的分化及血管通透性发挥联合调控作用［11，12］。另外，VEGF还能够诱导血管内皮细胞表达MMPs并分泌组织蛋白酶，通过对细胞外基质成分的降解减弱了基质的屏障作用，这为血管生长和异位子宫内膜的种植、增殖提供了有利条件，而异位内膜的生长又可表达更多的VEGF，后者进一步刺激新生血管形成，促进了病灶不断蔓延扩大。本研究结果显示，子宫内膜异位症患者组织和血清高表达MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2，与正常子宫内膜组织比较差异有统计学意义(P＜0.05)，且MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达与病变严重程度呈正相关，与有关研究结果［9，12］一致，说明MIF可能通过上调VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达促进了新生血管形成，在子宫内膜异位症发生发展过程中发挥协同促进作用。此外，本研究表明EM患者微血管密度明显高于正常人组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明EM患者异位内膜血管内皮细胞增生及新生血管形成较正常内皮细胞异常活跃，促进血管网的形成及异位病灶的蔓延扩散。

综上所述，本结果表明EM患者高表达 MIF、 VEGF、VEGFR1、VEGFR2，且R-AFS临床分期高者的表达水平越高，提示MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2在EM血管生成中发挥协同作用。MIF可能通过上调VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达诱导新生血管的形成。采用特异性siRNA、抗体或血管生成抑制剂下调MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表达有望为抑制异位病灶的植入、侵袭和转移提供基因治疗的新靶点。

1 Stilley JA，Birt JA，Sharpe-Timms KL.Cellular and molecular basis for endometriosis-associated infertility.Cell Tissue Res，2012，349:849-862.

2 Gregoric P，Doklestic K，Pandurovic M，et al.Distal ileal endometriosis as a cause of ileus:a case report.Srp Arh Celok Lek，2012，140:225.

3 郎景和.子宫内膜异位症研究的深入和发展.中华妇产科杂志，2010，45:241-242.

4 Conroy H，Mawhinney L，Donnelly SC.Inflammation and cancer:macrophage migration inhibitory factor(MIF)-the potential missing link. Quart J Med，2010，103:831-836.

5 Herrmann LC，Fraser D，Therriault MJ，et al.Interleukin-1 stimulates macrophage migration inhibitory factor secretion in ectopic endometrial cells of women with endometriosis.Am J Reprod Immunol，2007，58: 505-513.

6 Akoum A，Metz CN，AI-Akoum M，et al.Macrophagem igration inhibitory factor expression in the intrauterineendometrium of women with endometriosis varies with diseasestage，infertility status，and pelvic pain. Fertil Sterilm，2006，85:379-385.

7 Pan X，Mao X，Cheng T，et al.Macrophage migration inhibitory factor:a regulator of MMP13 and inflammation in titanium particles stimulated air pouch in vivo.Mol Cell Biochem，2011，357:313.

8 Baron N，Deuster O，Noelker C，et al.Role of macrophage migration inhibitory factor in primary glioblastoma multiforme cells.J Neurosci Res，2011，89:711.

9 文怡，黄金燕，钟振东，等.MIF表达与子宫内膜异位症血瘀证的相关性研究.南京中医药大学学报，2013，29:132-134.

10 Kang S，Zhao J，Liu Q，et al.Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms are associated with the risk of developing adenomyosis. Environ Mol Mutagen，2009，50:361-366.

11 Goteri G，Lucarini G，Zizzi A，et al.Pro-angiogenetic molecules，hypoxia-inducible factor-1 alpha and nitric oxide synthase isoforms in ovarian endometriosis cysts.Virchows Arch，2010，456:703-710.

12 Cho S，Choi YS，Jeon YE，et al.Expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)and its soluble receptor-1 in endometriosis.Microvasc Res，2012，83:237-242.