铜胁迫对铜绿微囊藻叶绿素荧光的影响

游 波，邓春暖*，夏春英，徐丽琼

(1．云南师范大学旅游与地理科学学院，云南昆明650500;2．山东省鲁南地质工程勘察院，山东兖州272100)

随着人类社会的发展，不少环境问题日益凸显出来。据了解，近十多年来，水体富营养化已成为一个全球性关注的环境问题。美国、德国、澳大利大、日本、台湾等二十多个国家和地区都曾对其境内的水库、淡水湖泊等饮用水源地中的水华现象进行过报道［1］。水源地的富营养化也是我国亟待解决的问题。近年来，水体富营养化问题日益严重。富营养化湖泊中形成的水华对城市供水安全构成直接的威胁。我国成为世界上蓝藻水华最严重、分布最广泛的国家之一。理论上，防治水体富营养化问题的根本方法是削减外源性营养盐，但对于已处于富营养化状态的水体而言，在藻类异常增殖时采取应急性工程措施最为关键，使其在短期内得到有效控制，提高处理水源地富营养化问题的效率［2］。微囊藻属又名多胞藻属。目前，世界上拥有25种，中国拥有18种，大部分种类呈现世界性分布，多生长于淡水水体中。当微囊藻藻种大量繁殖时，常在水面上形成一种绿色的粉末状团块，被称为水华。微囊藻的生长速度极快，并且大量释放毒素，对水生生态系统的健康、水体的正常功能构成严重的威胁。微囊藻也是引起蓝藻水华的最常见藻类之一。

近年来，国内外不少学者研究了水体富营化问题的应对措施，并且取得一定的成果。利用硫酸铜治理赤潮和水华是一种最常使用的方法。铜作为水体藻类的微量元素之一，其浓度的高低会对藻类生长存在一定的影响。有关研究表明，高浓度的铜离子对微囊藻藻细胞的某些结构和生长状态呈现显著的影响［3］。有研究表明，Cu2+能够抑制光合电子传递，使得光合作用CO2的固定受到阻碍;高浓度重金属离子可能主要通过影响蓝藻藻胆蛋白来抑制藻胆体的电子传递;铜绿微囊藻的生长对铜较敏感;铜绿微囊藻光合量子产额(Yield)、最大光化学效率(FV/FM)等荧光参数在重金属离子处理下出现较明显的变化趋势［4］。邓春暖等［5］研究表明，在高钙与铜同时处理的条件下，高钙使得铜离子对微囊藻生长的毒性加剧，表现为铜与高钙同时处理可降低最大光化学效率，显著抑制微囊藻细胞生长，同时降低光合电子传递速率等，增强铜对微囊藻PSⅡ的毒害。通过对各种荧光参数的分析，笔者研究了微囊藻受不同浓度Cu2+胁迫时的生长情况，以了解不同浓度铜离子对铜绿微囊藻的毒害作用。

1 材料与方法

1．1 试验材料 试验藻种为铜绿微囊藻，购自中国科学院水生生物所淡水藻种库。选用CuSO4·5H2O化学试剂进行铜离子胁迫，利用叶绿素荧光仪(FL3500，PSI，捷克)、紫外可见分光光度计(UV2800，上海Unico公司)等进行测试。

1．2 试验设计 用BG-11培养基培养微囊藻。在培养期间，温度为25℃，光照强度为30μmol/(m2·s)。将微囊藻培养到指数生长期，备用。每天取适量藻液，用紫外可见光光度计测定OD680值。

将CuSO4·5H2O溶解于去离子水中，配制不同浓度的CuSO4溶液。待藻达到指数生长期时，分别将20 ml藻液移入三角瓶中进行Cu2+处理。在藻液中计入不同浓度的Cu2+溶液，获得一系列添加不同铜离子浓度(0、0．010、0．050、0．075、0．100 mg/L)的藻液。每个处理设3次重复。以没有额外加入Cu2+的样品作为对照组。

1．3 叶绿素荧光参数的测定 叶绿素荧光参数是一组用于描述植物光合生理状况和光合作用机理的变量或常数，反映植物的“内在性”的特点，被称为研究植物光合作用与环境关系的内在探针。研究中，测定叶绿素荧光参数尤为重要。用叶绿素荧光仪(FL3500，PSI，捷克)进行快速上升荧光测量，测定F0(初始荧光，也称基础荧光，是光系统II反应中心处于完全开放时的荧光产量)、FM(最大荧光产量，即PS II反应中心处于完全关闭时的荧光产量)、FV(可变荧光强度)、FV/FM(最大光化学效率，反映PSⅡ反应中心内光能转换效率)、FV/F0(PSII的潜在活性)等荧光参数。在铜胁迫处理24 h后，测定其快速上升荧光曲线。在测定前，将各个微囊藻处理样品进行10 min暗适应。

1．4 数据处理分析 利用测得的叶绿素荧光曲线，分析以下荧光参数，其含义见表 1［5］。

表1 快速叶绿素荧光曲线JIP分析中使用的参数和公式

2 结果与分析

2．1 Cu2+处理对微囊藻FV/FM的影响 FV/FM为最大光化学效率，是重要的叶绿素荧光参数之一。研究FV/FM的变化差异对试验结果具有重要意义。

由图1可知，与控制组相比，4个试验组差异性均达到0．05显著水平。随着Cu2+浓度的增加，微囊藻的FV/FM受到的抑制程度增强。当加入0．01 mg/L浓度的Cu2+时，与控制组相比，受到4．9%的抑制;当加入0．05 mg/L浓度的Cu2+时，与控制组相比，受到8．4%的抑制;当加入0．075 mg/L浓度的Cu2+时，与控制组相比，受到15．4%的抑制;当加入0．1 mg/L浓度的Cu2+时，与控制组相比，受到17．6%的抑制。这些数据均表明，随着微囊藻溶液中铜离子浓度的增加，FV/FM不断减小，受到的抑制作用逐渐增强。

2．2 Cu2+处理对微囊藻能量分配比率的影响 为进一步了解不同浓度铜离子处理对微囊藻PSII的影响，试验中还需要对叶绿素荧光进行进一步的分析。由表2可知，在铜处理下，φD0呈现不同程度的上升，随着微囊藻藻液中所加入Cu2+浓度的上升，φD0也逐渐上升，而ΨO和φp0则出现不同程度的下降。φE0反映反应中心吸收的光能用于电子传递的量子产额，即反应中心吸收的光能将电子传递到电子传递链中QA下游的其他电子受体的概率。由此可知，铜胁迫对φE0没有显著的影响。

表2 微囊藻在加入不同浓度Cu2+处理后24 h能量分配指标的变化

2．3 Cu2+处理对微囊藻反应中心比活性参数的影响 ABS/RC是单位反应中心吸收的光能。从表3可以看出，在Cu2+处理下ABS/RC亦呈现不同程度的上升。与此相似的是DI0/RC，即单位有活性的反应中心耗散的光能，随着Cu2+浓度的增加呈不同程度的增长，而ET0/RC在前3组试验中逐渐减弱，说明铜胁迫对单位反应中心的电子传递有抑制作用。由此可知，铜胁迫下TR0/RC则没有显著的变化。

表3 微囊藻在加入不同浓度Cu2+处理后24 h反应中心比活性参数的变化

3 结论与讨论

铜是藻类生长所必须的元素，在植物的新陈代谢中承载着不可替代的作用。作为藻类光合作用和呼吸作用中多种酶的辅助因子，低浓度的铜离子能够提高酶的表达量，促进藻类光合作用和细胞的增长繁殖［3］，但高浓度的铜离子则可能抑制部分酶的活性，阻碍藻类光合作用，从而抑制藻类的增长。以往研究表明，高浓度的Cu2+会产生致毒作用，如抑制钝顶螺旋藻类生长和光合作用，其原生质膜的通透性会被改变，并且使K+从细胞中丧失［6］。也有研究表明，Cu2+对微囊藻的毒性效应表现在对叶绿素含量的持久抑制效应，Cu2+对微囊藻叶绿素的合成也存在不可逆的破坏作用，并且Cu2+可能抑制部分酶的活性，使得叶绿体结构和功能受到损害，干扰其对营养元素的吸收和转移［6］。

叶绿素荧光是进行光合作用的重要指标。要得到有关光能利用途径的信息，对各种叶绿素荧光参数的分析是必不可少的。植物的生长离不开光合作用。叶绿素含量会直接影响植物光合能力的强弱程度。有研究表明，Cu2+与叶绿素形成配位化合物，高浓度Cu2+会伤害到叶绿素，降低其含量，因此过量的Cu2+不利于叶绿素的形成和稳定［7］。还有研究表明，Cu、Hg、Ni、Zn等重金属离子能引起叶绿素酶活性的变化，使得叶绿素降解加快。此外，这些重金属离子可以代替叶绿素的中心镁原子，导致光合作用受到破坏［8－9］。有关试验结果表明，在高浓度金属胁迫下，斜生栅藻的光合量子产额、最大光化学效率等荧光参数均显著降低，而且随着重金属离子浓度的增加和胁迫时间的加长，上述参数的降幅越大［4］。上述的相关试验中采用的藻种为斜生栅藻，采用铜、锌、锰3种重金属离子分别与之发生胁迫作用，发现随着重金属离子浓度的增加，斜生栅藻的最大光化学效率受到的抑制作用增强。研究中，虽然采用的藻种不同，但是随着铜离子浓度的增加，铜绿微囊藻藻液的最大光化学效率呈现不同程度的下降趋势。

在高浓度铜离子与微囊藻藻细胞结合以后会与藻细胞发生相互作用，导致叶绿体结构呈现不同程度的破坏。前人研究表明，高浓度重金属铜离子与藻细胞的相互作用会引起膜蛋白空间结构和膜脂流动性的改变，并且解离膜蛋白复合物，从而对藻类的光合作用和能量传递造成影响，抑制蛋白质、核酸等物质的有效合成，进而使细胞正常的新陈代谢发生紊乱，其主要表现为藻体的电子传递速率、细胞密度、光和效率和叶绿素含量等呈显著下降［9－11］。夏建荣等［12］研究表明，铜胁迫会使以单位反应中心为单位的天线色素吸收的能量和用于热耗散的能量增加，电子传递的量子产额和捕获的激子能电子传递的效率明显下降。还有研究表明，在铜与高钙同时处理下，微囊藻生长所受的毒性加剧，致使微囊藻藻细胞的生长速度和PSII光化学效率、电子传递速率等均受到不同程度的抑制，增强重金属铜离子对微囊藻PSII的毒害作用［5］。研究中，铜胁迫作用除了对最大光化学效率、用来推动QA还原激子的比率、光合电子传递能力产生显著影响之外，也对用于热耗散的量子比率、单位有活性的反应中心耗散的光能、单位反应中心吸收的光能等也产生影响，具体表现为Cu2+浓度的增加降低了最大光化学效率、用来推动QA还原激子的比率、光合电子传递能力，表明在重金属铜离子的胁迫下微囊藻藻细胞的空间结构遭到破坏，使得藻细胞的生长速度受到抑制。而热耗散量子比率、单位反应中心耗散的能量、单位反应中心吸收的光能等荧光参数均呈增长趋势，在一定程度上减少铜胁迫对光系统II的损害。该研究结果进一步证明铜胁迫下微囊藻的各种叶绿素荧光参数发生变化，藻细胞的生长受到抑制。

总之，铜胁迫对微囊藻藻细胞的生长具有抑制作用。随着Cu2+浓度的增加，最大光化学效率、用来推动QA还原激子的比率、光合电子传递能力有所降低，表明在重金属铜离子的胁迫下铜绿微囊藻藻细胞的生长速度受到抑制。而热耗散量子比率、单位反应中心耗散的能量、单位反应中心吸收的光能则呈上升趋势，减少了铜胁迫对光系统II的损害。因此，在实际运用领域中，该研究结论可以作为解决水体富营养化中蓝藻水华问题的参考，如设置相适宜浓度的Cu2+来抑制藻类的生长等。

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