休闲卤豆干中腐败菌的分离鉴定

彭玲慧，吴菲菲，李化强，赵良忠，陈 浩，卜宇芳，刘 倩，李文强，徐纬，尹锦辉

(邵阳学院生物与化学工程系，湖南邵阳422000)

豆腐干是我国的传统美食，其主要原料是大豆，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、钙及B族维生素，营养均衡，易被人体消化吸收［1］。豆腐干有卤干、熏干、酱油干等，由于其营养丰富，含有大量蛋白质、脂肪、碳水化合物，还含有钙、磷、铁等多种人体所需的矿物质，有“植物肉”的美称。休闲卤豆干，是将豆腐干经过卤制、调味、杀菌等工艺制成的口味多样、营养丰富、适宜旅游休闲等的即食豆腐干食品。

近年来，随着我国休闲食品的发展，休闲豆腐干以其良好的口感，在休闲食品市场越来越受消费者的欢迎，仅湖南邵阳地区在2014年豆制品产值就达30亿元［2］。休闲豆腐干虽然产量在逐渐增加，但由于其富含蛋白质，营养丰富，很容易滋生微生物而导致腐败变质［3］，再加上豆腐干加工的工艺复杂，生产周期长，因而与外界环境的接触增加了微生物污染的机会;另外还有机械化程度低、手工操作多等因素，不同生产企业的加工环境和设施以及操作人员等差异［4］，导致生产过程中微生物污染更加难以控制，目前由微生物污染而导致豆制品腐败的问题已成为制约豆制品大规模产业化的瓶颈之一［5］。因此，笔者以真空包装腐败变质的卤豆干为研究对象，从中分离纯化出优势微生物，通过形态学特征、生理生化试验及Sensititre微生物自动鉴定仪等方法鉴定真空包装豆腐干中腐败微生物，以期为休闲卤豆干的生产能更好地控制该微生物的污染提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1．1 材料 供试原料:真空包装卤豆干，湖南恭兵食品有限公司。主要试剂:革兰氏染液、甲醇、0．5%碱性复红染色液、蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉、葡萄糖、氯化钠、酵母浸膏等，均由邵阳学院生物与化学工程系实验室提供。

主要仪器设备:高压灭菌锅(LDZX-75KB型)，上海申尖医疗器械厂;恒温培养箱(HP X-9272MBE型)、电热鼓风干燥箱(GZX-9140 MBE型)，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;G1200127N移液枪(1 ml和100μl)、EL20 pH计、电子天平(EL204)，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;恒温水浴槽(SY-1210数显)，上海柯维仪器有限公司;超净工作台(SW-CJ-1F)，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;自动快速微生物鉴定仪，英国SENSITITRE公司。

1．2 方法

1．2．1 腐败菌的分离纯化。在无菌条件下，取出已经胀包酸败的卤豆干，用无菌剪刀剪碎后，再用无菌镊子夹取一小部分豆腐干加入到经高压灭菌的LB培养基中，置37℃，120 r/min，摇床增菌培养12 h。10倍梯度稀释至10－7，吸取100 μl菌悬液均匀涂布于营养琼脂培养基，37℃培养18～24 h。挑取单个典型菌落接种于营养琼脂培养基上，分离纯化，得到纯种。

1．2．2 形态观察。观察细菌菌落形态，挑取单个菌落，用火焰固定，进行革兰氏染色，在显微镜下对细菌进行形态学观察［6］。

1．2．3 腐败菌的菌种鉴定。

1．2．3．1 富集培养。将分离纯化后的纯培养物接种于营养琼脂培养基上，划线培养，于37℃的恒温培养箱中培养18～24 h。

1．2．3．2 浊度调整。取装有标准接种液的浊度管，在浊度仪上调至100%，用灭菌棉签挑取培养好的菌落，在无菌状态下接种到浊度管中，测量，直到调至90% ～97%标准浊度值。

1．2．3．3 接种鉴定板。将调整好浊度的菌液倒入V型加样槽，用移液器将菌液加入到微孔鉴定板上，于35℃条件下培养。

1．2．3．4 读取数据。开启鉴定系统，将已培养16～24 h的微孔鉴定板放到Sensititre微生物自动鉴定仪的读数仪上，按照可能性大小给出1～2种可能菌株的名称。

1．2．4 优势腐败菌相关生理生化试验。根据Sensititre微生物自动鉴定仪鉴定出来的结果，结合GB 26427－2010对分离出的优势腐败菌进行MYP试验、溶血试验、动力试验以及蛋白质结晶毒素试验。

1．2．4．1 MYP试验。挑取已分离纯化的单菌落，划线在甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂平板上，37℃培养18～24 h，观察是否有粉红色菌落且周围有晕圈。

1．2．4．2 溶血试验。挑选纯化的菌落划线，接种在血琼脂平板表面，37℃培养(24±2)h，观察菌落形态以及是否出现溶血环。

1．2．4．3 动力试验。用接种针挑取选出的菌落穿刺接种于动力培养基中，37℃培养(24±2)h，观察动力反应。

1．2．4．4 蛋白质结晶毒素试验。取经37℃培养(24±2)h并于室温放置2～3 d的培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。待自然干燥后用弱火固定。于涂膜处滴加甲醇，30 s后倾去甲醇，置火焰上干燥。接着滴加0．5%碱性复红染色液，置火焰上加热至微见蒸汽(勿使染液沸腾)后维持1．5 min，移去火焰，将载玻片放置0．5 min，倾去染液。用洁净自来水彻底漂洗、晾干、镜检。在油镜下观察有无游离芽孢和深染的似菱形的小结晶体。

1．2．5 腐败卤豆干中菌落计数。根据GB 4789．2－2010，在无菌操作下，称取腐败变质豆腐干25 g，加入盛有225 ml灭菌生理盐水中无菌均质杯内，8 000～10 000 r/min均质1～2 min。用1 ml无菌吸管吸取1∶10样品匀液1 ml，沿管壁缓慢注入盛有9 ml稀释液的无菌试管中，制成1∶100的样品匀液。重复以上步骤，制备10倍系列稀释样品匀液，梯度稀释到10－7～10－1。选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，分别吸取1 ml稀释液转入到灭菌平皿中，每个稀释度做2个平皿，同时，分别吸取1 ml空白稀释液加入到2个无菌平皿内作空白对照。将凉至46℃的营养琼脂培养基注入平皿约15 ml，转动平皿使其混合均匀。将制好的平板置于(36±1)℃恒温箱中培养(48±2)h后，观察菌落生长和分布情况，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

2 结果与分析

2．1 腐败卤豆干中细菌鉴定结果 从腐败卤豆干中分离出1株典型的菌落，命名为菌株A，将接种菌落的营养琼脂平板置于37℃培养箱中培养18 h后，观察平板上有典型的菌落生长。其菌落形态及细菌形态见图1。腐败豆腐干中细菌菌落和细胞显微镜形态如下:菌株编号为A，培养基为牛肉膏蛋白胨，90%以上的菌株为阳性反应，菌落形态近似圆形，有光泽，似蜡烛样，菌落大，直径5～7 mm，表面粗糙，扁平，细胞形态特征为G+，杆状，末端方，呈短或长链。

根据试验结果，从腐败变质卤豆干中分离出的菌株经分离纯化后，进行革兰氏染色，通过光学显微镜观察，从显微图片可以明显看到该菌为革兰氏阳性菌，呈长杆状。

2．2 Sensititre32型全自动细菌鉴定仪鉴定

2．2．1 A号菌株的鉴定结果。A号菌株的鉴定结果见表1。根据表1可以得出，A号鉴定板在培养18 h后，系统给出的最大可能结果是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其PROB值为100%。

表1 A号菌株培养18 h后鉴定结果

2．3 生理生化试验结果 根据Sensititre微生物自动鉴定仪鉴定出的结果，结合GB 26427－2010对分离出的菌种分别进行了MYP试验、溶血试验、动力试验以及蛋白质结晶毒素试验，结果见图2～5及表2。根据形态观察及生理生化测定结果，该分离菌株的生理生化结果与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)相符。

表2 菌株A的生理生化特征

根据Sensititre微生物自动鉴定仪鉴定结果及相关生理生化试验可以判断该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

2．4 菌落计数 按照GB 4789．2－2010的要求，对腐败卤豆干中的细菌进行计数，经计算得出腐败卤豆干中的细菌数量是1．2 ×106CFU/g。

3 结论

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种在自然界广泛分布的好气性、产芽孢的杆菌，通常处于孢子和休眠的状态。蜡样芽孢杆菌一般不会致病，但有的菌株能导致食物中毒症状［7］，主要为腹泻型和呕吐型2种［8］。蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒是最常见的食物中毒之一，但目前各国并未强制要求检测食品中蜡样芽孢杆菌含量。

该试验通过对分离细菌进行培养特性、生理生化特性以及Sensititre微生物自动鉴定仪鉴定，最后得出该分离的细菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

休闲卤豆干是我国目前比较受广大消费者喜爱的休闲食品，其丰富的营养价值及适宜的口感是其受消费者喜爱的主要原因。但是其在保存时期的受微生物污染而导致的腐败胀包问题一直是影响休闲豆腐干生产和销售的主要原因，而各地工厂由于生产环境及原料不同，导致影响豆腐干腐败的微生物也不一定相同。因此，该研究结果可以为邵阳休闲卤豆干生产中蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的控制采取针对性措施，从而延长货架期，提高豆腐干的质量，为工厂在生产豆腐干过程中的防腐措施提供一定参考。

［1］陈金财．休闲豆制品行业现状及未来发展方向［J］．农产品加工(创新版)，2009(7):52 －54．

［2］谢玲．休闲豆腐干行业突破短板放眼全国［J］．农产品加工，2012(7):8－9．

［3］王红戟，陈娅，林沛璋．豆腐加工过程中微生物污染的调查与对策［J］．中国卫生检验杂志，2008(6):275．

［4］梁荣蓉，张一敏，李飞燕，等．鸡肉调理制品生产过程中污染微生物的调查研究［J］．食品科学，2010(5):275．

［5］石彦国，任莉．大豆制品工艺学［M］．北京:中国轻工业出版社，1996:13－25．

［6］于源华．生物工程与技术专业实验教程［M］．北京:化学工业出版社，2009:37－48．

［7］KOTIRANTA A，LOUNATMAA K，HAAPASALO M．Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections［J］．Micro Infect，2000(2):189－198．

［8］周帼萍，袁志明．蜡样芽孢杆菌污染及对食品安全的影响［J］．食品科学，2007，28(3):357 －361．