正交法优化废次烟叶中水溶性多糖提取工艺

刘燮，罗健，张燕，田军熊，谭小龙，涂云彪，陈波

(西昌学院农业科学学院，四川西昌615013)

我国是世界烟草种植大国，年产烟叶300万t左右，占世界总产量约40%。每年生产的烟叶中有20%～30%为废次烟叶［1－2］，这些烟叶不能用做卷烟原料，若无合理利用途径，将造成巨大的浪费，也会造成环境的污染。废次烟叶中含有多种活性化学成分，是生产保健品、食品、药品、化妆品的重要原料［3－5］。因此，近年来废次烟叶的综合加工利用技术成为研究的热点，其中对于烟碱、绿原酸、茄尼醇等的提取纯化工艺研究较多［6－10］，但对多糖提取技术研究仍较少［11－12］。多糖是植物体内普遍存在的一类活性物质，具有增强免疫、抗氧化、降血压等多种作用［13－16］。笔者以提取液中多糖含量为指标，比较不同的提取条件对烟叶多糖提取率的影响，旨在为进一步综合利用废次烟叶奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 原料:废次烟叶，2014年生产烤烟红花大金元，由西昌学院农业科学学院提供。

主要试剂:浓硫酸、无水乙醇、蒽酮、硫脲、葡萄糖等试剂，均为分析纯。

主要仪器:Q-506B2型高速多功能粉碎机，UNIVERSAL 320R型高速冷冻离心机，600型三用水箱，202-3A型电热恒温干燥箱，WP-RO-10型超纯水机，KQ5200DE型数控超声波清洗器，1900PCS型双光束紫外可见分光光度计等。

1．2 试验方法

1．2．1 原料预处理。将废次烟叶置于60℃烘箱中烘干，将干燥后的烟叶除去烟梗，粉碎并过80目筛，于干燥器中保存备用。

1．2．2 水提取工艺及正交设计。准确称取3 g预处理的烟叶粉末，放入200 ml三角瓶中，按照料液比(m/V)加入ddH2O，用玻璃棒搅拌均匀后，放入恒温水浴箱中加热，然后在4 000 r/min离心机中离心10 min，取上清液定容至100 ml，即得废次烟叶多糖提取液。

选择料液比、提取温度、提取时间3个因素，各设4个水平(表1)，采用SPSSStatistics17．0的正交设计程序设计正交试验，得16个处理，每个处理重复4次，每次重复平行测定4次，以提取液中多糖含量为评价指标，优选最佳水提取工艺，并进行3次重复验证试验。

1．2．3 超声提取工艺及正交设计。除加热设备改为KQ5200DE型数控超声波清洗器(超声波功率为30 kHz，电功率为200 W)而外，其余流程同“1．2．2”。

正交试验选择料液比、提取温度、提取时间3个因素，各设4 个水平(表1)，设计方法同“1．2．2”。

1．2．4 酶法提取工艺及正交设计。在“1．2．2”的基础上，处理体系中分别加入浓度为100 mg/ml的果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶各0．16 ml，放入恒温水浴箱中加热，其余工艺流程同“1．2．2”，正交试验设计见表1。

1．2．5 多糖含量测定。参照文献，采用蒽酮－硫酸法测定［17］烟叶提取液中多糖含量，蒽酮试剂现配现用，并加入硫脲做稳定剂。

1．3 数据处理 利用SPSS 17．0软件的一般线性模型单变量分析程序处理试验数据。

表1 正交试验因素水平

2 结果与分析

2．1 葡萄糖标准曲线 准确取1 ml浓度分别为0．02、0．04、0．06、0．08、0．10、0．12、0．14、0．16、0．18、0．20 mg/ml葡萄糖标准溶液于具塞的试管中，再加入5 ml蒽酮试剂(立刻摇匀，并置于冰水浴中)，置沸水中水浴10 min，快速放入冰水浴中冷却10 min，以蒸馏水为空白对照，在波长为626 nm处测定吸光度。根据测量结果计算线性回归方程y=3．372 3x+0．215 3(R=0．965 6)。

利用标准曲线回归方程，根据蒽酮－硫酸法测定的多糖吸光度A，可以计算出反应液中多糖的浓度C(mg/ml):C=(A －0．215 3)/3．372 3。

2．2 水提取工艺条件优化 水提取工艺正交试验方差分析得出:F料液比=59．96＊＊，F提取温度=46．72＊＊，F提取时间=7．54＊＊。由此表明，料液比、提取时间和提取温度对多糖的提取影响均达到极显著水平。3个因素对多糖提取的影响程度大小依次为料液比、提取温度、提取时间。

水提取工艺的正交试验结果表明(表2)，料液比、提取时间和提取温度的最佳工艺条件为A2B4C4，即料液比为1∶15 g/ml，提取时间为105 min，提取温度为90℃。正交试验中，处理5(A2B1C2)，多糖含量最高，达到(9．02 ±0．50)mg/ml，其次为处理8(A2B4C1)，多糖含量达到(8．75 ±0．50)mg/ml，以及处理 6(A2B2C4)，多糖含量为(8．73 ±0．80)mg/ml。采用最佳工艺条件A2B4C4，进行3次重复验证，提取液中多糖含量为(9．56±0．32)mg/ml，高于正交试验的最高处理。

2．3 超声提取工艺条件优化 方差分析得出，F料液比=224．04＊＊，F提取温度=0．64，F提取时间=15．56＊＊。由此表明，在超声提取工艺条件中，料液比和提取时间对结果影响极显著，而温度对多糖的提取影响不显著。3个因素对多糖提取的影响程度大小依次为料液比、提取时间、提取温度。

超声提取工艺的正交试验结果表明(表3)，料液比、提取时间和提取温度的最佳工艺条件为A2B2C3，即料液比为1∶15 g/ml，提取时间为25 min，提取温度为40℃。正交试验中，处理5(A2B1C3)多糖含量最高，达到(10．57 ±0．15)mg/ml;其次为处理8(A2B4C2)，多糖含量达到(10．54±0．14)mg/ml;以及处理6(A2B2C1)，多糖含量为(10．13 ±0．43)mg/ml。采用最佳工艺条件A2B2C3进行3次重复验证，提取液中多糖含量为(10．61 ±0．22)mg/ml，略高于正交试验的最高处理。

表2 水提取工艺正交试验结果

表3 超声提取工艺正交试验结果

2．4 酶法提取工艺条件优化 由方差分析得出，F料液比=175．14＊＊，F提取温度=0．62，F提取时间=2．03。由此可知，在酶法提取工艺条件中，料液比对结果影响极显著，而温度和时间对废次烟叶水溶性多糖的提取影响不显著。3个因素对多糖提取的影响程度大小依次为料液比、提取时间、提取温度。

酶法提取工艺的正交试验结果表明(表4)，料液比、提取时间和提取温度的最佳工艺条件为A1B1C2，即料液比为1∶10 g/ml，提取时间为50 min，提取温度为40℃。在16个正交试验中，处理2(A1B2C3)多糖含量最高，达到(8．78±0．70)mg/ml;其次为处理3(A1B3C4)，多糖含量达到(8．31 ±0．35)mg/ml;以及处理1(A1B1C1)和处理4(A1B4C2)，多糖含量分别为(8．28 ±0．34)mg/ml和(8．27 ±0．30)mg/ml。采用最佳工艺条件A1B1C2进行3次重复验证，提取液中多糖含量为(8．56±0．41)mg/ml，略低于正交试验的最高处理。

表4 酶法提取工艺正交试验结果

3 结论与讨论

多糖分子中含有大量羟基，具有较强极性，易溶于水，不溶于醇，因此利用此特性，采用水提醇沉法提取和纯化多糖，是一种低成本、易操作、适合大规模工业生产的常规方法。水提取法需要通过加热来使细胞壁膨胀裂解，从而有利于细胞内多糖的溶解。此外，还可以通过微波、超声波等的机械作用破坏细胞壁，也可以添加果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶等分解细胞壁，促进细胞内多糖的溶出，从而提高提取效率。超声波和酶都可以起到破坏细胞壁、释放细胞内容物的作用。当超声功率和作用时间足够时，温度的作用可以忽略，因此在一定的超声条件下，反应体系的温度对提取效率的影响可能不显著。酶具有生物活性，其活性程度具有最适温度范围，因此温度在此范围内的变化对提取效率的影响都不显著。

该试验分别采用水提取工艺、超声提取工艺和酶法提取工艺提取废次烟叶多糖。结果表明，超声辅助工艺的提取效率最高，在最佳工艺条件下，提取液中的多糖含量可以达到(10．61±0．22)mg/ml;其次为水提取工艺，最佳条件下多糖含量可以达到(9．56±0．32)mg/ml;最后是酶法提取工艺，最佳条件下多糖含量为(8．56±0．41)mg/ml。3种工艺相比，超声工艺提取效率最高，提取时间短、温度低，但需要投入额外设备;水提取工艺提取效率居中，提取温度最高，时间最长，但条件简单，易操作;酶法提取效率最低，也需要辅助成本，但料液比低、温度低、时间短。

水提取废次烟叶多糖的最佳工艺条件为:料液比为1∶15 g/ml，提取时间为105 min，提取温度为90℃，提取多糖含量为(9．56±0．32)mg/ml;超声提取废次烟叶多糖的最佳工艺条件为:料液比为1∶15 g/ml，提取时间为25 min，提取温度为40℃，提取液中多糖含量为(10．61±0．22)mg/ml;酶法提取废次烟叶多糖的最佳工艺条件为:料液比为1∶10 g/ml，提取时间为50 min，提取温度为40℃，提取液中多糖含量为(8．56 ±0．41)mg/ml。

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