西瓜抗枯萎病种质资源的分子标记筛选研究

王吉明，李楠楠，尚建立，李娜，徐永阳，马双武

(中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009)

西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f．sp．niveurn)寄生引起的一种世界性真菌土传病害，严重制约西瓜的生产［1-4］。目前西瓜抗枯萎病育种主要采用人工接种鉴定技术进行抗性选择，易受环境和接种技术的影响，存在鉴定时间长、准确性差、鉴定效率低等缺点，分子标记技术鉴定具有不易受环境影响，鉴定时间短，准确性高，鉴定效率高等优点，可作为分子辅助选择的重要工具，随着分子生物学的发展，研究者已对西瓜枯萎病病菌1号生理小种的抗病基因(Fon-1)进行定位［5-8］。笔者采用张屹等［8］发表的西瓜枯萎病生理小种1抗性基因紧密连锁Caps标记“fon_7716”对130份不同类型西瓜种质进行抗性基因分子检测分析，以期为西瓜抗枯萎病抗原筛选和分子辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1．1 试验材料 供试材料为国家西瓜甜瓜中期库(河南，郑州)提供的西瓜种质资源，包括地方品种、育成品种(系)和野生种质，共计130份(表1)，具有较为广泛的代表性。

1．2 试验方法

1．2．1 DNA提取。于西瓜果实膨大期取蔓上幼嫩真叶用于基因组 DNA的提取，采取 CTAB法提取基因组 DNA［9］。

1．2．2 PCR 反应体系。扩增反应体系 25 μl，包括 12．5 μl 2×Taq Master Mix，2 μl模板 DNA，10 μmol/μl上、下游混合引物2μl，ddH2O 8．5μl。扩增反应程序:94℃预变性 5 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。2×Taq Master Mix购自北京百泰客生物技术有限公司。引物7716_fon为张屹等［8］已发表的西瓜抗枯萎病基因分子标记，由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。7716_fon 引 物 序 列 为:5′-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3′，5′-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3′。

1．2．3 CAPS反应与分析。PCR产物采用 Taq I进行酶切，酶切识别位点为T′CGA，酶切体系为 15 μl，含有 1．5 μl 10 ×Buffer;1．0 μl限制内切酶Taq I;5 μl PCR 产物，7．5 μl H2O。酶切程序:65℃酶切16 h，80℃变性20 min，4℃保存。限制性内切酶购自Fermentas公司。

扩增/酶切产物采用8．0%聚丙烯酰胺电泳，280 V恒定电压下电泳50 min，银染显色后拍照分析;PCR产物酶切后电泳出单条带170 bp判定为抗病基因型，出现单条带104 bp为感病基因型，同时出现170和104 bp 2条带为抗/感病杂合基因型。

2 结果与分析

2．1 PCR及Caps酶切结果 130份西瓜种质资源的总DNA提取后均扩增出170 bp条带，但条带较浅;采用Taq I酶切后部分种质的PCR产物出现104 bp条带和一条70 bp左右的条带，将170 bp和104 bp条带判定为抗病和感病基因型(图1)。

2．2 种质资源基因型鉴定 在130份种质资源中，45份种质资源表型为抗病基因型(+)，80份种质资源为感病基因型(-)，5份种质资源为抗/感病杂合基因型(+/-)(表1)。

2．2．1 地方品种基因型鉴定。在34份地方品种类型种质资源中，21份种质鉴定为抗病基因型，占供试地方品种总数的61．8%。抗病基因型种质包括著名的地方品种三白瓜、抚州瓜、马铃瓜、喇嘛瓜、陕西白、黑崩筋等食用西瓜，以及郑州籽瓜、大板红籽瓜、皋兰籽瓜、宁夏红籽瓜、大安子瓜等籽瓜。

2．2．2 野生种质资源基因型鉴定。选用13份野生种质进行了抗性基因型鉴定，结果鉴定出3份抗病基因型种质，分别为PI 494530、PI 494528、PI 595203，占供试野生种质总数的23．1%，其余均为感病基因型种质。

2．2．3 育成品种基因型鉴定。在82份育成品种(系)类型种质资源中，鉴定出21份抗病基因型种质，主要为久比例、Smokylee、Sugarlee等国外育成品种，以及红1号、中育10号、中育1号和96B41等国内育成品种(系)，占供试育成品种(系)种质总数的25．6%;另鉴定出5份杂合基因型种质，分别为 Jan-06、All Sweet、Dixielee、开杂5 号-1、AB 系;其余为感病基因型种质，主要为查理斯顿、Black Stone、Calhoun Gray、Black diamond、Crimson Sweet等国外育成品种和中育9号、兴城红、火洲1号、无杈早、苏蜜1号、中汴一号等国内育成品种。

表1 西瓜种质资源抗枯萎病生理小种1基因型鉴定

续表1

3 讨论

该研究采用Caps标记“Fon_7716”对我国部分西瓜种质资源包括地方品种、野生种质、育成品种(系)3种不同类型的种质资源进行了抗枯萎病生理小种1的基因型鉴定，结果表明抗性基因型种质比例偏高，如我国地方西瓜品种通常认为不抗枯萎病，但在34份我国地方西瓜品种中，有21个品种表现为抗病基因型，抗性种质比例高达61．8%，表明抗性基因型和表型抗性性状之间出现一定的偏差，推测不同类型种质资源之间存在较大的抗性背景遗传差异，有待进一步研究;此外一些公认的抗性种质如PI296341是目前认为兼抗枯萎病生理小种0、1、2的材料，而Calhoun Gray则是开发“Fon_7716”标记的抗性亲本材料，这些种质在该研究中均表现为感病基因型，出现这种情况可能与采用的试验材料与之前报道用的材料来源不同，或在繁殖更新过程中抗性基因丢失有关。在育成品种(系)中，Sugarlee、Smokylee、红1号等是抗枯萎病育种中较为常用的抗性材料，该研究鉴定为抗病基因型，与表型抗性性状相符。

不同西瓜种质资源材料其抗病基因可能各不相同，抗性遗传和表型规律也相差很大，枯萎病抗性遗传可能受多个基因协同控制［10-18］，采用单一分子标记难以全面从整个种质资源角度筛选和鉴定抗性种质，因此十分有必要继续从分子水平开展枯萎病的抗性遗传和抗性机理研究，并开发更多紧密连锁的分子标记。

［1］徐润芳，杨鼎新．我国西瓜抗枯萎病育种的进展与前景［J］．中国西瓜甜瓜，1992(1):2-5．

［2］周凤珍，康国斌．西瓜部分抗枯萎病材料的抗性遗传研究［J］．中国西瓜甜瓜，1996(2):17-18．

［3］ZHANGZ G，ZHANGJY，WANG Y C，et al．Molecular detection of Fusarium oxysporum f．sp．niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil［J］．FEMSmicrobiol lett，2005，249(1):39-47．

［4］徐瑞富，刘软林，刘起丽，等．西瓜枯萎病菌的生物学特性研究［J］．河南科技学院学报(自然科学版)，2013(2):36-40．

［5］XU Y，OU Y X，ZHANG H Y，et al．Identification of a RAPD marker linked to Fusarium wilt resistant gene in wild watermelon germplasm(Citrullus lanatus var．citroides)［J］．Acta botanicasinica，1999，41(9):952-955．

［6］许勇，张海英，康国斌，等．西瓜抗枯萎病育种分子标记辅助选择的研究［J］．遗传学报，2000，27(2):151-157．

［7］LEIGH K，FENNY D．Draft of RAPD map of watermelon［J］．American society for horticultural science，2001，126(3):344-350．

［8］张屹，张海英，郭绍贵，等．西瓜枯萎病菌生理小种1抗性基因连锁标记开发［J］．中国农业科学，2013，46(10):2 085-2 093

［9］MURRAY M G，THOMPSON W F．Rapid isolation of high molecular weight plant DNA［J］．Nucleic acids research，1980，8(19):4 321-4 325．

［10］GRALL J M．History and present status of watermelon improvement by breeding［J］．Soil Sci，1953，13:71-74．

［11］HENDERSON WR．The inheritance of Fusarium wilt resistance in watermelon［J］．JAm Soc Hort Sci，1970，95:276-282．

［12］NETZER D．Inheritance of resistance in watemelon to races of Fusarium oxysporurn［J］．Plant disease，1980，164(9):853-854．

［13］黄学森，张学炜，焦定量，等．西瓜部分品种抗枯萎病特性在 F1代中遗传表现的初步探讨［J］．中国西瓜甜瓜，1991(2):11-15．

［14］ZHANGX P，RHODESB．Inheritance of resistance to race0，1 and 2 of Fusarium oxysporum f．sp．niveum in Watermelon(Citrullus sp．P1296341)［J］．CGCreport，1993，16:77-78．

［15］周凤珍，康国斌．西瓜抗枯萎病品种“卡红”的抗病遗传研究［J］．植物病理学，1996，26(3):261-262．

［16］张国良，崔广海．西瓜枯萎病抗性材料的转育及遗传规律的研究［J］．安徽农业科学，1999，27(6):616-618．

［17］于利，徐润芳，赵有为．西瓜品种抗枯萎病遗传研究［J］．江苏农业学报，1995，11(1):45-48．

［18］羊杏平，姚怀莲，刘广，等．西瓜品种枯萎病抗性的遗传研究［J］．江苏农业学报，2008，24(6):882-887．