实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响及管理

□沈 刚SHEN Gang

乙型病毒性肝炎是我国传播范围最广、危害性最大的一种感染性疾病，以肝脏炎性病变为主要表现，容易在此基础上继发肝硬化、慢性肝炎和原发性肝细胞癌等严重疾病，危及患者生命安全[1]。乙肝病毒是乙型病毒性肝炎的感染病毒，当前对其检测最为有效的方法即为实时荧光定量PCR（聚合酶链式反应）检测技术，其将荧光标志技术与PCR技术相结合，在对乙肝病毒DNA的检测中具有特异性强、灵敏度高等优点[2]，但是HBV-DNA的检测目前还没有一个统一的标准，对于相同标本，使用不同仪器、不同试剂检测所得出的结果差别较大。本研究对采用实时荧光定量PCR方法检测乙肝DNA的影响因素进行分析，同时提出有针对性的管理建议，现报告如下。

资料与方法

1.临床资料。选取2011年8月至2014年10月我院收治并已确诊的395例乙型肝炎病毒感染患者为研究对象，其中男性184例，女性211例；患者年龄16～65岁，平均(49.75±9.53)岁。

2.方法。对395例患者进行血标本制作，空腹状态下抽取肘静脉血，置入黄盖血清管，离心后取血清进行实时荧光定量PCR检测乙肝DNA。核酸扩增条件：95℃条件下预变性3min，94℃(30sec) 60℃（15sec）循环40次，反应结束后，制作标准曲线，计算得出标本中的DNA模板量，根据试剂盒的阳性质控标准进行标本的阳性质控。本研究中所用试剂为艾康生物科技有限公司生产的乙肝DNA检测试剂盒，所用仪器为美国ABI公司生产的StepOne实时荧光定量分析仪。以临床诊断结果为对照标准，对比实时荧光定量PCR检测乙肝DNA结果差异，并对导致两者间差异的影响因素进行分析。

3.统计学分析。采用SPSS20.0统计软件进行分析，计数资料以频率及百分率表示，组间比较采用配对卡方检验，检验水准а=0.05。当P＜0.05时，差异具有统计学意义。

结果

1.检测结果对比。通过实时荧光定量PCR技术检测乙肝DNA确诊374例，占94.7%，漏诊误诊21例，占5.3%，两者对比差异未见显著性差异(P＞0.05)，说明该方法的诊断准确率较高。

2.影响因素分析。对影响检测结果的因素进行分析，主要包括实验室条件、标本操作（标本抗凝血操作、标本贮存与溶血和血脂影响）以及核酸提取方法等。见表1。

表1 影响因素分析

讨论

1.实验室条件影响因素。PCR技术的最大特点是具备极高的灵敏度，但同时极其微量的污染即可造成假阳性结果的产生[3]。因此，临床基因扩增检验实验室的技术验收和规范化管理是在临床上应用此项技术的基本前提。临床基因扩增检验实验室原则上应分为四个单独的工作区域，包括试剂贮存区、标本制备区、扩增区及扩增产物分析区，另外对人员培训和操作规程也有具体要求。本研究中，由于实验室条件影响因素造成漏诊误诊3例，占14.3%，说明实验室的硬件建设与软件规范均应有所加强。

2.标本因素影响。包括标本抗凝血因素、贮存因素及溶血和血脂因素等。

2.1 标本抗凝血因素。由于机体在感染乙肝病毒后会血液中会出现乙肝病毒DNA，因此HBV-DNA的检测一般都以血清或血浆作为标本。正常情况下EDTA抗凝(紫管)血浆、枸橼酸钠(黑管)血浆都可以用于进行HBV-DNA PCR检测。EDTA与枸橼酸钠虽然都能结合Mg2+，但由于水平充足，不会影响最终的检测结果[4]。而肝素作为核酸检测常用的血液抗凝剂，能抑制聚合酶的活性，被公认为PCR反应抑制剂，在使用肝素作为抗凝素时，会导致标本的裂解失效，实时荧光定量PCR无法对血浆和血清进行有效检测，产生假阴性结果。因此在PCR检测中，尽量避免使用肝素作为抗凝剂。

2.2 标本存储的影响。由于标本量及检测周期原因，大部分实验室不会每天进行HBV-DNA检测，因此标本的贮存相当重要。由于细胞内的酶对DNA具有降解，如静止时间超过3小时，或贮存温度超过25℃时，会造成标本变性，影响检测结果[5]。所以临床贮存标本HBV-DNA应在及时分离血清或血浆的前提下，将其于-20℃以下环境贮存。

2.3 溶血及血脂因素。溶血和血脂会造成血液内血红蛋白变形，导致荧光信息强度发生变化，影响检测结果。理论上讲血红素可以经卟琳环与Taq酶发生不可逆的结合，从而抑制后者活性，因此标本发生溶血时会对HBV-DNA的检测结果带来明显影响。但也有实验证明，对发生溶血的HBV-DNA标本与未溶血标本之间检测结果进行对比，差异并无统计学意义(P＞0.05)，其原因或许在于血红蛋白经100℃10分钟后，已经发生变性，丧失了结合Taq酶的活性，或者在提取核酸前，经过高速离心沉淀HBV颗粒、弃去上清等处理，大大降低了血红蛋白带来的影响。血脂因素可导致荧光淬灭，降低荧光信号强度，同时脂肪或其代谢产物能抑制Taq酶的活性，降低扩增效率，导致检测结果降低。但亦有实验证明，高血脂对检测结果并无显著影响。尹琦和徐玉蝉等[6]研究发现，三酰甘油小于或等于45.96 mmol/L时，并不会对检测结果产生影。

黄翔等[7]通过PEG沉淀煮沸法发现，在胆固醇未高于12mmol/L情况下同，HBV-DNA的检测结果与胆固醇水平间并无显著相关性，说明PEG沉淀煮沸法能有效地去除标本中的胆固醇，提高扩增效率。

3.核酸提取方法的影响。采用不同的核酸提取方法对于采用实时荧光定量PCR技术检测血清HBV-DNA结果差异较大[8]。李金明等[9]研究发现，在应用PCR技术对HBV-DNA进行检测时，使用煮沸裂解法处理血清标本的效果较差，而应采用核酸纯化方法。陈晓东等[10]认为，磁珠核酸提取法应作为PCR技术中检测中的首选方法，其检测结果与沉淀煮沸裂解法和直接煮沸裂解法均存在显著性差异(P＜0.05)，其中直接煮沸裂解法的提取效率最低，少于磁珠核酸提取法两个数量级。

通过上述分析，我们认为在应用实时荧光定量PCR对HBV-DNA进行检测时，需注意以下几点：首先要严格规范实验室硬件与软件建设，规范实验室检查条件，严格遵循分区原则，实验室人员要严格单向走动，避免跨区操作，同时在室内安装通风设备，注意对空气有可能会引起检查误差的物质进行及时排除。其次，严格进行试剂盒的选择；采集标本时要防止污染，避免表皮、体液细胞及头发等成分的混入；处理标本采用带滤芯吸头，并保证一人一个吸头，防止发生气溶胶污染；在标本贮存时采用专用冰箱，对于拆封及未拆封的试剂分开放置，认真登记有效期；最后，对实验室人员进行培训，以提高专业技能，掌握仪器必要的使用和维护技术，定期对仪器及用具进行严格消毒。

综上所述，实时荧光定量PCR在HBV-DNA的检测中准确率较高，具有较高应用价值，但仍有一定的漏诊和误诊率，需加强管理，在多方面进行综合预防。

1 郭楠，李宝萍，李慧萍，等. 反应体系对荧光定量PCR检测乙肝核酸结果影响的分析[J].中国实验诊断学，2013,17(5)：877-879

2 范公忍，韩聚强，胡学玲，等.两种核酸提取方法对血清HBV DNA荧光定量检测结果的影响[J].中国卫生检验杂志，2013,23(9)：2110-2112,2114

3 郝维敏，刘杰，杨晓春.标本因素对荧光定量PCR检测HBV DNA的影响[J].蚌埠医学院学报，2011,36(3)：295-297

4 高国生，姜俊，翁彭剑.不同标本因素对荧光定量PCR法测定HBV DNA结果的影响[J].现代实用医学，2010,22(1)：37-38

5 胡玉弘，陈玲玲，冯军.标本存放时间对荧光定量PCR检测HBV-DNA结果的影响[J].中国医学创新，2010,7(24)：7-8

6 尹琦，徐玉蝉.影响HBV DNA测定的标本因素[J].临床检验杂志，2008,26(2)：133-134

7 黄翔，王晖，周志明，等.溶血和脂血标本中乙肝病毒DNA提取方法的选择与评价[J].华中医学杂志，2004,28(2)：123-124

8 梅玉峰，黄敏，危艳顺.浓缩裂解煮沸法在荧光定量PCR测定HBV DNA中的应用[J].检验医学与临床，2009,6(5)：359-360

9 李金明，王露楠，邓巍.标本处理对聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸的影响[J].中华检验医学杂志，2000,23(6)：337-339

10 陈晓东，陶志华，周武.核酸提取方法在聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸中的评价[J].中华检验医学杂志，2002,25(4)：212-214