肠杆菌科细菌外排泵AcrAB-TolC调控机制的研究进展

程玉谦，祁伟(天津医科大学第二医院，天津300211)

肠杆菌科细菌外排泵AcrAB-TolC调控机制的研究进展

程玉谦，祁伟
(天津医科大学第二医院，天津300211)

摘要:AcrAB-TolC外排泵广泛存在于肠杆菌科细菌中，其基因表达水平的提高对临床菌株多重耐药起重要作用。细菌AcrAB-TolC外排泵系统产生多重耐药性的机制是将细菌细胞内的抗生素主动泵出，使细胞内药物浓度下降。外排泵AcrAB-TolC的调控主要有局部调控和全局调控两种方式，调节基因AcrR、marOR、ramR及soxRS的突变可以导致AcrAB操纵子过表达，有助于细菌产生多重耐药表型。

关键词:肠杆菌科;外排泵;调控机制;多重耐药

主动外排机制对细菌多重耐药性的产生起重要作用［1，2］。AcrAB-TolC外排泵由细菌外膜通道蛋白TolC、内膜外排转运蛋白AcrB及膜融合蛋白AcrA组成。其中AcrA位于周质间隙，连接AcrB和TolC，以三聚体形式穿越细菌内膜和外膜，主动将菌体内的物质泵出细胞外。现已证实，外排泵AcrABTolC广泛存在于肠杆菌科细菌(大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌、产气肠杆菌、志贺菌等)中，是重要的外排系统，它受局部调节因子AcrR及全局调节因子MarA-SoxS-Rob系统的调控［3，4］。本文对肠杆菌科细菌外排泵AcrAB-TolC调控机制的研究进展作一综述。

1　外排泵AcrAB-TolC对细菌多重耐药的作用机制

外排泵AcrAB-TolC以质子驱动力为能源，通过AcrB捕获和转运底物。AcrB的外周胞质发夹环具有结合药物分子的作用，当AcrB与药物分子结合时，其构象发生改变，随之通过级联放大效应，进一步引起AcrA和TolC构象改变，AcrB和TolC相互接触，通道开放。在生理状态下，AcrAB-TolC的表达有助于菌株抵抗肠道的胆盐、脂肪酸等疏水性物质的入侵;但AcrAB-TolC的高表达表现出对多种化合物的耐受，如各种抗生素(β-内酰胺类抗生素、四环素、氯霉素、大环内酯类、甲氧苄啶及喹诺酮类抗生素等)以及其他毒素复合物(吖叮黄、三氯生、去污剂、染料和有机溶剂)。外排泵系统可将细菌细胞内的抗生素主动泵出，使细胞内药物浓度下降。近年来研究证实，AcrAB-TolC外排基因高水平表达对于临床菌株多重耐药性有重要作用［5，6］。

2　肠杆菌科细菌外排泵AcrAB-TolC的调控方式

外排泵AcrAB-TolC的调控主要有局部调控和全局调控两种方式，其局部调控蛋白主要为AcrR，全局调控蛋白主要有MarA、Rob、SoxS、RamA等。调节基因AcrR、MarOR、RamR及SoxRS的突变可以导致AcrAB操纵子的过表达，有助于细菌产生多重耐药表型。

2.1局部调控AcrR是一种负性调控因子，包括215个氨基酸，由位于泵基因上游141 bp的阻遏基因AcrR编码，与AcrAB启动子上的24个碱基对构成的反转重复序列结合，抑制自身及AcrAB基因的表达。AcrR同转录抑制子TetR有共同的N末端序列和相似性结构。AcrR折叠形成9个α-螺旋结构，由DNA结合区和配体结合区组成。N末端的3个螺旋区形成典型的螺旋-转角-螺旋结构，是其与DNA链的结合位点，结构相对保守; C末端区为底物结合位点，形成1个配体结合口袋，能够调节多种配基，表明AcrR是一种多药结合蛋白。当AcrR与底物结合后，N端即与DNA链分离，启动AcrAB基因表达。AcrR抑制子的突变有助于AcrB的过表达。研究发现，AcrR第45位氨基酸位于螺旋-转角-螺旋DNA结合区的中间，这一位点相对保守，其突变会导致AcrAB表达增加，在抗生素耐药性中起重要作用［7］。AcrAB的过表达不依赖于AcrR的活性，但是当AcrAB过表达后，AcrR的活性在调节AcrAB的表达中可能起到重要作用。沙门菌中AcrR的突变导致75位异亮氨酸和76位谷氨酸的复制，有助于AcrAB的过表达。

2.2全局调控调节因子MarA、SoxS、Rob及RamA属于AraC/XylS家族，共同构成MarA-SoxS-Rob调控系统，作为单体结合由20 bp组成的非对称序列AYNGCACNNWNNRYYAAAYN (N代表任何碱基，R代表A或G，W代表A或T，Y代表C或T)，这个结合位点称为marbox。marbox出现在调节基因(如AcrAB、TolC、MarRAB)启动子上游; SoxS和MarA结合到marbox的不同基因，不同程度地激活AcrAB转录而提高外排泵表达。调节基因表达水平的提高同操纵子的基因突变或诱导剂的结合位点突变有关。此外，这些转录调节因子之间也存在交叉调节作用，如SoxS的缺失可以降低MarA的表达，反之亦如此。

2.2.1MarRAB操纵子Mar操纵子是细菌对外界环境压力反应的调控中心。Gorge等于1983年首次在大肠埃希菌染色体上发现Mar操纵子，后证实其广泛存在于肠杆菌科细菌中;其序列在肠杆菌科细菌中相对保守，在细菌多重耐药中起重要作用。MarRAB操纵子包括:启动子MarO、阻遏基因MarR及阳性转录调节子MarA、MarB。MarR是Mar操纵子转录阻遏蛋白，以同二聚体形式与MarO结合，负性调节MarRAB的转录; MarA是一种转录激活蛋白，与MarRAB操纵子上游区MarO中的Marbox结合，不仅调节自身转录，也调节Mar调节子的表达;目前MarB的功能未知。Vinué等［8］研究结果表明由216 bp基因编码的MarB作为胞质周质蛋白，可能作为一种参与细胞调节因子的信号，抑制Mar-RAB启动子。MarRAB的转录亦可由MarA的同系物SoxS和Rob激活。在氟喹诺酮耐药的大肠杆菌中，MarR抑制子的突变导致MarRAB操纵子的组成型表达［9］; MarR抑制子暴露于水杨酸盐也可以减低RarR的抑制作用，提高MarA的表达。研究认为MarOR基因第1 376～1 379处的4个碱基缺失，可使志贺菌对部分抗生素的耐药性增加［10］。

2.2.2SoxS和Rob SoxS属于AraC/XylS家族成员之一，是SoxRS超氧化反应调节子的效应基因，受SoxR正向调节。SoxR是一种组成型表达的同二聚体转录调节子，它包括具有氧化还原活性的铁-硫簇;这些铁-硫簇的氧化反应激活SoxR，从而触发了SoxS基因的转录。在大肠杆菌及沙门菌临床株和实验株中，SoxRS调节子的激活有助于提高菌株对喹诺酮、奈叮酸和氯霉素的耐药性。SoxS的组成型表达源于SoxR C末端的突变。在体外诱导耐药的大肠杆菌突变株中发现SoxR第125位天冬酰胺被赖氨酸代替，这个位点临近包括4个半胱氨酸的C末端簇，导致SoxS的过表达。Zheng等［11］研究结果表明，在氟喹诺酮耐药的鼠伤寒沙门菌LTH中，SoxR基因出现3个碱基替代(T313、C317、C321)，产生了两个氨基酸残基的改变，导致SoxS的过表达并参与了细菌对氟喹诺酮的耐药性。O' Regan等［12］也发现SoxR的突变(第20位精氨酸变为组氨酸)提高了SoxS的表达并有助于沙门菌产生多重耐药性。Fàbrega等［13］发现，在诺氟沙星体外诱导耐药的大肠埃希菌突变株NorE5中，SoxS和MarA的表达水平明显提高;对SoxRS的测序发现在402位插入两个腺嘌呤，在134位赖氨酸处插入1个读码框，在7个密码子后产生了终止子，使得C末端的氨基酸缺失;此外该研究也提示MdtG基因是MarASoxS-Rob调控系统中的一部分，其产物MdtG过度表达能够导致耐药性增加，MdtG的marbox破坏后，MarA、SoxS、Rob的诱导能力均下降。相关研究表明，SoxR 136～144位氨基酸的缺失(影响最后19个氨基酸)也可导致SoxS的组成型表达。Kehrenberg等［14］在沙门菌中发现SoxR基因内49个碱基插入参与SoxS上调及提高了外排活性。在大肠杆菌中，Rob的过表达通过激活AcrB而赋予细菌多重耐药表型。

2.2.3RamA除了MarA/SoxS/Rob家族，George等［15］发现并证实了RamA作为AraC/XylS家族的另一成员，对克雷伯菌的多重耐药性起到重要作用。最近相继在阴沟肠杆菌、产气肠杆菌及沙门菌中发现RamA基因; RamA结合位点位于AcrAB基因上游，是沙门菌外排泵AcrAB-TolC的主要调节因子，其主要作用是促进AcrAB基因的表达，有助于细菌对氟喹诺酮及多重耐药性的产生［16］。RamR位于RamA基因上游，作为RamA的抑制子调节RamA基因的表达。RamR的结合位点覆盖RamA启动子的主要特征，包括-10保守区、RamA的转录起始位点和2个长7 bp的翻转重复序列。RamR及RamRRamA区的基因突变在RamA和AcrAB的上调中起重要作用，从而赋予泵介导的多重耐药表型。相关研究发现，RamR区6个氨基酸(T18P、R46N、R46P、Y59H、M84I和E160D)的替代同细菌的多重耐药性相关［14，16，17］。在鼠伤寒沙门菌中，由RamR点突变所致氨基酸的替代或框移位、RamA启动子的缺失以及由于IS1启动子的插入导致RamR的失活均导致了外排泵基因表达水平的提高及多重耐药性的产生。Abouzeed等［16］报道在鼠伤寒沙门菌DT104中，RamA上游2个碱基对的缺失在RamA和AcrAB的上调中起重要作用;而Zheng等［18］的研究表明在氟喹诺酮耐药的沙门菌中，RamA启动子区9个碱基的缺失，其中也包括Abouzed报道的2个碱基的缺失，推测可能是RamR的结合位点，激活了RamA。Kehrenberg等［14］发现在沙门菌中RamR-RamA区不同位置的突变及SoxR基因的突变均可导致AcrAB外排泵的上调，包括点突变、RamR基因10～15个碱基缺失以及RamR结合位点的单个碱基的替代。Zheng等［18］的研究结果表明，组成型RamA转录水平的提高可以导致细菌多重耐药表型，在菌株LTL中，最低抑菌浓度水平的提高伴随AcrAB和RamA的组成型过表达;而已知的调节子如MarA和SoxS的表达水平没有变化，表明RamA是AcrAB表达的激活子。

综上所述，外排泵AcrAB-TolC对肠杆菌科细菌多重耐药性起重要作用，而其复杂的调控机制需要进一步研究和探索，为新型抗菌药物或外排泵抑制剂的研究提供重要的靶作用位点;此外，通过对外排泵AcrAB-TolC结构和调控机制的深入研究，为细菌其他外排系统的研究提供思路。

参考文献:

［1］Swick MC，Morgan-Linnell SK，Carlson KM，et al.Expression of multidrug efflux pump genes AcrAB-TolC，mdfA，and norE in Escherichia coli clinical isolates as a function of fluoroquinolone and multidrug resistance［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(2) : 921-924.

［2］Pérez A，Poza M，Fernández A.Involvement of the AcrAB-TolC efflux pump in the resistance，fitness，and virulence of Enterobacter cloacae［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56 (4) : 2084-2090.

［3］Hobbsa EC，Yin X，Paula BJ，et al.Conserved small protein associates with the multidrug efflux pump AcrB and differentially affects antibiotic resistance［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109 (41) : 16696-16701.

［4］Yu L，Lu W，Ye C，et al.Role of a conserved residue R780 in Escherichia coli multidrug transporter AcrB［J］.Biochemistry，2013，52(39) : 6790-6796.

［5］Yasufuku T，Shigemura K，Shirakawa T.Correlation of overexpression of efflux pump genes with antibiotic resistance in Escherichia coli strains clinically isolated from urinary tract infection patients ［J］.J Clin Microbiol，2011，49 (1) : 189-194.

［6］Aathithan S，French GL.Prevalence and role of efflux pump activity in ciprofloxacin resistance in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30(6) : 745-752.

［7］Pourahmad Jaktaji R，Jazayeri N.Expression of acrA and acrB Genes in Esherichia coli Mutants with or without marR or AcrR Mutations［J］.Iran J Basic Med Sci，2013，16(12) : 1254-1258.

［8］Vinué L，McMurry LM，Levy SB.The 216 bp marB gene of the MarRAB operon in Escherichia coli encodes a periplasmic protein which reduces the transcription rate of MarA［J］.FEMS Microbiol Lett，2013，345(1) : 49-55.

［9］Sato T，Yokota S，Uchida I.Fluoroquinolone resistance mechanisms in an Escherichia coli isolate，HUE1，without quinolone resistance-determining region mutations［J］.Front Microbiol，2013，(4) : 125.

［10］任静朝，段广才，宋春花，等.志贺菌主动外排泵调控基因MarOR突变与泵表达水平的关系［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2010，30(3) : 201-204.

［11］Zheng J，Cui S，Meng J.Effect of transcriptional activators RamA and SoxS on expression of multidrug efflux pumps AcrAB and AcrEF in fluoroquinolone-resistant Salmonella Typhimurium［J］.J Antimicrob Chemother，2009，63(1) : 95-102.

［12］O'Regan E，Quinn T，Pagès JM.Multiple regulatory pathways associated with high-level ciprofloxacin and multidrug resistance in salmonella enterica serovar enteritidis: involvement of ramA and other global regulators［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(3) : 1080-1087.

［13］Fàbrega A，Martin RG，Rosner JL，et al.Constitutive SoxS expression in a fluoroquinolone-resistant strain with a truncated SoxR protein and identification of a new member of the MarA-SoxS-Rob regulon，mdtG［J］.Antimicrob Agents Chemother，2010，54(3) : 1218-1225.

［14］Kehrenberg C，Cloeckaert A，Klein G，et al.Decreased fluoroquinolone susceptibility in mutants of Salmonella serovars other than Typhimurium: detection of novel mutations involved in modulated expression of ramA and soxS［J］.J Antimicrob Chemother，2009，64(6) : 1175-1180.

［15］George AM，Hall RM，Stokes HW.Multidrug resistance in Klebsiella pneumoniae: a novel gene，ramA，confers a multidrug resistance phenotype in Escherichia coli［J］.Microbiology，1995，141 (Pt8) : 1909-1920.

［16］Abouzeed YM，Baucheron S，Cloeckaert A.RamR mutations Involved in efflux-mediated multidrug resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52 (7) :2428-2434.

［17］Akiyama T，Khan AA.Molecular characterization of strains of fluoroquinolone-resistant Salmonella enterica serovar Schwarzengrund carrying multidrug resistance isolated from imported foods［J］.J Antimicrob Chemother，2012，67(1) : 101-110.

［18］Zheng J，Cui S，Meng J.Effect of transcriptional activators RamA and SoxS on expression of multidrug efflux pumps AcrAB and AcrEF in fluoroquinolone-resistant Salmonella Typhimurium［J］.J Antimicrob Chemother，2009，63(1) : 95-102.

(收稿日期:2015-01-06)

通信作者:程玉谦

基金项目:天津医科大学科学基金资助项目(2010KY47)。

文章编号:1002-266X(2015)21-0095-03

文献标志码:A

中图分类号:R378.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.039