柚苷酶处理、果汁浓缩和低温贮藏对柚子果汁中柠檬苦素的影响

刘 棠，杨远帆，杜希萍，黄良仕，肖安风，倪 辉,* ，Feng CHEN

（1.厦门出入境检验检疫局，福建 厦门 361012；2.集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.福建省平和县农业局，福建 漳州 363700；4.克莱姆森大学食品、营养与包装科学系，美国 南卡罗莱娜 克莱姆森 29631）

柚苷酶处理、果汁浓缩和低温贮藏对柚子果汁中柠檬苦素的影响

刘 棠1，杨远帆2，杜希萍2，黄良仕3，肖安风2，倪 辉2,* ，Feng CHEN4

（1.厦门出入境检验检疫局，福建 厦门 361012；2.集美大学食品与生物工程学院，福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.福建省平和县农业局，福建 漳州 363700；4.克莱姆森大学食品、营养与包装科学系，美国 南卡罗莱娜 克莱姆森 29631）

采用高效液相色谱法测定柠檬苦素含量，以柚子果汁为对象研究柚苷酶处理、果汁浓缩和低温贮藏等工序对柑橘果汁中柠檬苦素含量的影响。结果表明，液相色谱方法可使柠檬苦素、普鲁宁、柚皮苷和柚皮素完全分离，消除了柚皮素对柠檬苦素测定的影响；柠檬苦素检出限为0.95 μg/mL，定量限为3.17 μg/mL，样品回收率为102.6%～104.2%，相对标准偏差为0.34%～1.04%。柚苷酶水解过程中的加热及果汁浓缩和低温贮藏等操作都能促进柠檬苦素的从果汁中结晶析出，综合采用柚苷酶 水解、浓缩和低温贮藏等操作，并经过离心分离可去除柚汁中78%的柠檬苦素，使果汁中柠檬苦素含量降低到19 ☒g/mL。

高效液相色谱；柚子；果汁；柠檬苦素；柚苷酶

柚皮苷和柠檬苦素是柑橘类果汁的主要苦味物质[1]，柚皮苷是一种黄酮类化合物，它是果汁的前苦味物质[2]；而柠檬苦素是一类三萜系化合物，它的存在导致很多柑橘类果汁产生强烈的“后苦味”[3-4]；这些苦味物质是限制酸橙和柚子等柑橘类水果的加工利用的最主要因素。

虽然某些树脂和β-环糊精对柚皮苷和柠檬苦素具有很强的吸附能力，但并未广泛应用于工业生产，主要原因是它们在吸附这两种苦味物质的同时，也会吸附大量的营养成分和风味成分[5-7]。酶法脱苦成为近年来的研究热点。研究表明，用霉菌来源的柚苷酶可以高效地去除柑橘果汁中的柚皮苷[8-11]。此外，某些微生物可以合成具有柠檬苦素转化作用的酶类，如柠檬苦素-D-环内酯水解酶、柠檬苦素类化合物葡萄糖基转移酶和柠檬苦素脱氢酶，这些酶在碱性条件下可以将柠檬苦素转化为无苦味的柠檬苦素糖苷和17-脱氢柠檬苦素类A-环内酯[12-13]，但在柑橘果汁的酸性环境下则不稳定甚至失去活性，限制了其在柑橘果汁加工中的应用。因此，柠檬苦素的存在是用酶法脱苦生产酸橙和柚子果汁的主要障碍。

在前期研究中，已筛选出了能够合成柚苷酶的菌株，而且分离纯化得到了能去除柚子果汁苦味的柚苷 酶[14-18]，并已应用于去除琯溪蜜柚果汁的柚皮苷。因此，本实验在前期研究基础上，利用高效液相色谱法测定柠檬苦素含量变化，研究柚苷酶处理、浓缩、低温贮藏等加工工艺对柚汁中柠檬苦素的影响，为开发标准化的柚子果汁生产技术提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

琯溪蜜柚，由福建省国农农业发展有限公司（中国福建省平和县产）提供。

柚皮苷、柚皮素、柠檬苦素和普鲁宁标准品 美国Sigma公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Tedia公司；硫酸铵及其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪（配有2487紫外检测器、System Breeze系统控制和数据处理工作站、Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm））、Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱 美国Waters公司；Cary50型紫外分光光度计 美国Varian公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；超滤装置（配有直径50 mm、孔径0.45 μm的滤膜） 天津市津腾实验设备有限公司；TDL-40B离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 柚苷酶制备

按照Chen Yuelong等[10]方法以柚皮苷为唯一碳源培养棘孢曲霉JMUdb058，并用硫酸铵沉淀法收集发酵产物中的柚苷酶，其中硫酸铵沉淀的饱和度范围为40%～80%。所获得的柚苷酶活力为355.0 U/mL。

1.3.2 标准溶液的制备

柚皮苷、柚皮素、柠檬苦素和普鲁宁先用乙腈溶解配制成500 μg/mL的贮存溶液，—20 ℃保存备用，使用时按需要用乙腈稀释成适当的质量浓度。

1.3.3 柚子汁的制备

柚子剥去外果皮，将果肉切碎、榨汁，将所得柚汁（可溶性固形物含量为10%）冷藏备用。

1.3.4 柠檬苦素的提取

先用2.0 mL甲醇活化Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱，再用2.0 mL去离子水平衡。将柚子果汁于4 000×g离心10 min后取1 mL上样于Sep-Pak Plus C18微固相萃取小柱，用1 mL去离子水淋洗后用1 mL 60%乙腈溶液进行洗脱，收集洗脱液，过0.22 μm滤膜后备用。

1.3.5 高效液相色谱条件

色谱条件在相关文献[19]的基础上进行并略作调整。进样量20 μL，柱温35℃，流动相为水（A）和乙腈（B），以0.5 mL/min流速进行梯度洗脱，梯度条件：0～4 min，95% A；4～14 min，60% A；14～16 min，保持60% A；16～24 min，30% A；24～28 min，95% A；28～32 min，保持95% A；检测波长为210 nm。

1.3.6 标准曲线绘制和检出限及定量限分析

用60%乙腈将柠檬苦素标准品配制成质量浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、150、200、250 μg/mL的标准溶液，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制柠檬苦素的标准曲线，并拟合线性回归方程及相关系数。以3 倍信噪比所对应的样品溶液质量浓度作为检出限，10 倍信噪比所对应的样品溶液质量浓度作为定量限。

1.3.7 准确度和精密度

采用加标回收率进行方法准确度的评价。以Sep-Pak Plus C18固相萃取小柱处理过的柚子果汁为空白溶液，在其中定量加入柠檬苦素标准溶液，使加标后溶液的柠檬苦素质量浓度分别为30、60、90 μg/mL，测定柠檬苦素含量（n=5），计算样品空白加标回收率（即检测值与理论值的百分比）和相对标准偏差。

1.3.8 柚苷酶处理柚汁过程中柠檬苦素结晶析出的测定

分别以未经处理和加热处理的柚子果汁为对照，比较柚苷酶处理对果汁中柠檬苦素结晶析出的影响。其中，加酶处理组是在100 mL果汁中加入5 mL柚苷酶液，50 ℃酶解60 min后，加热到100 ℃，保持15 mL灭酶；加热处理组是在100 mL果汁中加入5 mL经过灭活的柚苷酶液，其他条件同加酶处理组。每隔10 min取样，4 000×g离心10 min去除结晶沉淀中的柠檬苦素，测定果汁上清液中的柠檬苦素含量。

1.3.9 果汁浓缩和低温贮藏对柠檬苦素的影响

在50 ℃条件下对未经处理和经加酶处理的柚子汁进行真空浓缩，浓缩至可溶性固形物含量达到20%，将浓缩前后的果汁置于4 ℃和—20 ℃环境下，存放12 d，每4 d取样1 次，离心去除沉淀后测定上清液中的柠檬苦素含量，将测得的柠檬苦素含量除以2，折算成与未浓缩果汁相同体积中所含有的柠檬苦素含量，以未浓缩的果汁为对照，对比分析浓缩处理及贮藏条件对柠檬苦素含量的影响。

1.3.10 柚苷酶处理、浓缩和低温贮藏等工序对去除柠檬苦素含量的贡献率分析

以柚子果汁为原料，依次进行柚苷酶处理、真空浓缩（至可溶性固形物含量达到20%）、4 ℃贮藏4 d，取样离心后测定每个阶段的柠檬苦素含量。

1.4 数据处理

每个实验平行3 次，应用SPSS 17.0软件计算平均值和标准偏差，并对结果进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 柚子果汁中柠檬苦素的测定方法的建立及评价

由图1可见，采用的液相色谱方法可实现柚皮苷、普鲁宁、柚皮素和柠檬苦素的完全分离，保留时间分别为14.5、14.9、19.1 min和22.7 min，各峰形对称而尖锐，相互间的分离度均大于1.5，说明这4 种物质达到了完全分离。按1.3.6节方法，计算得柠檬苦素回归方程为y=29 225x+8 350，R2值为1。这是说明柠檬苦素在质量浓度6.25～250 μg/mL范围内具有良好的线性。根据基线的噪声，按照1.3.6节的方法计算得到柠檬苦素的检出限和定量限分别是0.95 μg/mL和3.17 μg/mL。按照1.3.7节方法测定回收率和精密度，结果（表1）表明，柠檬苦素在低、中、高3 个添加水平下的回收率介于102.6%～104.2%之间，说明其检测值可代表实际理论值；用3 个不同添加水平下分别进行5 次平行实验，测定的相对标准偏差介于0.34%～1.04%之间，均小于5%，说明该方法具有较好的重复性。目前已报道了一些检测柑橘果汁中的柚皮苷、柚皮素和柠檬苦素的高效液相色谱方法[10,20-21]，但忽略了柚皮苷和柚皮素对柠檬苦素测定的影响。当用柚苷酶对柑橘果汁进行脱苦时，柚皮苷被水解生成柚皮素[21]。由于柚皮素与柠檬苦素的极性较相近，且在检测柠檬苦素的波长处（210 nm）也具有强吸收（图1），因此，可能影响柠檬苦素测定。本研究采用高效液相色谱方法实现了柚皮素和柠檬苦素的完全分离，并且具有良好的定量限、回收率和精密度，因此，可以精确测定经柚苷酶处理的柑橘果汁中的柠檬苦素含量。

2.2 柚苷酶处理对柚汁中柠檬苦素的影响

图2 表明，随着柚苷酶处理时间的延长，果汁上清液中柠檬苦素含量呈现下降趋势，前20 min内下降明显；处理20 min时，柠檬苦素去除率达到27.0%，随后下降趋势平缓，去除率趋于稳定，柚苷酶处理至60 min时，柠檬苦素去除率为33.6%。此外，在沉淀中检测到大量的柠檬苦素。图3表明，以灭活的酶液代替柚苷酶液对果汁进行处理（保温及加热），二者上清液中柠檬苦素含量相当，这说明引起柚子果汁上清液中柠檬苦素减少的原因是加热处理，而不是柚苷酶水解作用，该结果与邬应龙等[22]

研究结果相一致。相关文献表明，在水中柠檬苦素的溶解度仅5 μg/mL，但在柚子和其他柑橘果汁中柠檬苦素的溶解度更高，主要是因为果胶将柠檬苦素包裹在其网状结构中形成稳定的胶体结构[23-24]。当果汁受热时，果胶溶液的黏度会降低，柠檬苦素分子碰撞聚合的机率增大，导致柠檬苦素结晶析出，这可能是柚苷酶处理后果汁上清液中柠檬苦素质量浓度降低主要原因。

2.3 浓缩及低温贮藏对柚汁中柠檬苦素的影响

由图4可以看出，4 种果汁中的柠檬苦素含量随着放置时间的延长，整体呈下降趋势，且均在4 d后趋于平缓；同时，图4还表明，柠檬苦素在—20 ℃和4 ℃贮藏条件下，溶解度无显著差异，所以两种贮藏温度条件下柠檬苦素含量的变化情况也基本一致；比较浓缩前后果汁中柠檬苦素含量可知，经浓缩处理后果汁中柠檬苦素含量明显降低。上述研究结果表明，柚苷酶处理过程中的加热、浓缩、低温贮藏（4 ℃）等工序均可促进琯溪蜜柚果汁中柠檬苦素含量的降低。

由图5可以看出，柚子果汁经柚苷酶处理、浓缩、4 ℃贮藏4 d后，经离心后其柠檬苦素含量分别下降了30%、17%、31%，总去除率达到78%，经以上处理后，浓缩柚汁折算成与未浓缩果汁相同体积含有的柠檬苦素含量为19 ☒g/mL。相关研究表明，柠檬苦素在饮料中的苦味阈值为10～14 ☒g/mL[25]。以此为标准，经过柚苷酶水解处理、浓缩、冷藏制备得到的浓缩果汁即使用于生产果汁含量高于50%的果汁饮料，其柠檬苦素的含量也低于其苦味阈值。此外，前期研究表明，经过柚苷酶处理后，琯溪蜜柚中柚皮苷的含量可去除90%以上，即使用于生产果汁含量100%的饮料产品，柚皮苷的含量也低于其苦味阈值[11]。因此，本研究表明，在柑橘类果汁加工过程中，可以综合运用酶处理、浓缩、低温贮藏而同时去除柚皮苷和柠檬苦素的苦味。

3 结 论

本实验建立了一种准确测定柑橘类果汁中柠檬苦素的高效液相色谱方法，并发现加热、浓缩和低温贮藏等操作能促进柚子果汁中柠檬苦素的结晶析出。柚子果汁经过柚苷酶水解、浓缩并在4 ℃贮藏4 d后，经过离心分离沉淀，果汁的柠檬苦素去除率可达到78%，浓缩柚汁中残留的柠檬苦素在加工成果汁（19 ☒g/mL）饮料后不会引起苦味。因此，该研究可为柑橘类果汁加工及开发利用提供技术参考。

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Effects of Naringinase Treatment, Juice Condensation and Low-Temperature Storage on Limonin in Pummelo Juice

LIU Tang1, YANG Yuanfan2, DU Xiping2, HUANG Liangshi3, XIAO Anfeng2, NI Hui2,*, Feng CHEN4
(1. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Brueau, Xiamen 361012, China; 2. Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering, College of Food Science and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 3. Fujian Provincial Agriculture Bureau of Pinghe County, Zhangzhou 363700, China; 4. Department of Food, Nutrition and Packaging Sciences, Clemson University, Clemson SC 29631, USA)

Naringin and limonin are the major compounds responsible for the bitter taste of citrus juice. Although naringin could be effectively transformed to a nonbitter chemical by naringinase, limonin is hard to be removed from citrus juice. Naringenin is the hydrolysis product of naringin, and always disturb the determination of limonin in case of HPLC analysis due to similar polarity and overlapped absorbance spectra with naringin. In order to develop the juice processing and debittering process on the basis of naringinase treatment, a high performance liquid chromatography (HPLC) procedure was established and used to study the effects of naringinase treatment, condensation and low-temperature storage on limonin in pummelo juice. The results showed that the HPLC method achieved complete separation of limonin from naringin, prunin and naringenin, which protected correct determination of limonin by removing the disturbance from naringenin. The limit of detection, limit of quantification, recoveries and relative standard deviations (RSDs) were 0.95, 3.17 μg/mL, 102.6%–104.2% and 0.34%–1.04% for limonin, respectively. Moreover, heat treatment, concentration and storage at low temperatures could promote crystallization and make it easy to eliminate limonin from pummelo juice. By using a combined process consisting of naringinase treatment, condensation, storage at low temperature and centrifugation of limonin crystal, 78% of the limonin was removed from the juice, thus resulting in a pummelo juice containing 19 ☒g/mL of limonin.

high performance liquid chromatography (HPLC); pummelo; juice; limonin; naringinase

TS255

A

1002-6630（2015）04-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201504001

2014-05-20

国家自然科学基金面上项目（31271914）；厦门市杰出青年科学基金项目（3502Z20126008）；集美大学科研创新团队基金项目（2010A006）

刘棠（1980—），男，工程师，硕士，主要从事食品分析与检测研究。E-mail：203008@qq.com

*通信作者：倪辉（1973—），男，教授，博士，主要从事食品酶学和食品发酵研究。E-mail：nihui@jmu.edu.cn