超声波辅助酶预处理对糙米发芽及发芽糙米理化特性的影响

刘俊飞，汤晓智*，扈战强，代飞云，方 勇，胡秋辉

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

超声波辅助酶预处理对糙米发芽及发芽糙米理化特性的影响

刘俊飞，汤晓智*，扈战强，代飞云，方 勇，胡秋辉

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023）

结合超声波和外源酶对糙米进行预处理，利用中心组合试验模型，以超声温度、超声时间、酶质量浓度3 个因素为自变量，糙米预处理后处理液中总糖含量、糙米发芽率、发芽糙米γ-氨基丁酸（γ-amiobutyric acid，GABA）含量为响应值，设计了三因素三水平的响应面分析试验，并对数据进行拟合和相关性分析。同时研究超声波辅助酶预处理对发芽糙米中G ABA含量、总酚含量、内源淀粉酶活力以及发芽糙米糊化黏度、蒸煮后质构特性的影响。结果表明：超声辅助酶预处理的超声温度和超声时间对糙米发芽率和GABA含量均有显著的影响。通过响应面分析，超声波辅助酶预处理超声温度31.21 ℃、超声时间0.71 h、酶质量浓度0.28 g/L时，发芽率最高预测值为91.98%；超声波辅助酶预处理超声温度35.65℃、超声时间0.5 h、酶质量浓度0.22 g/L时，GABA含量最高预测值为38.25 mg/100 g。从发芽糙米的理化特性来看，超声波辅助酶预处理有利于GABA的富集，但不利于总酚的积累。超声波辅助酶预处理可以有效地提高内源淀粉酶的活力，相应地降低发芽糙米粉的糊化黏度以及发芽糙米蒸煮后的硬度。

超声波；酶；发芽糙米；理化特性

稻谷（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物，世界上已有一百多个国家种植培育，一半以上的人口以其为主食[1]。糙米是稻谷经脱壳后所得，由于其保留了完整的糠层和胚芽，营养价值远高于精白米[2-4]。但是，也由于糠皮的存在，造成糙米有一种糠的不愉快气味，糙米糠层中高含量的纤维素及其复合物使糙米适口性、加工性、消化性均很差，从而限制了糙米的广泛食用。

发芽糙米相比糙米拥有较好的应用前景，糙米发芽过程中，内源酶被激活，分解部分生物高分子化合物，如淀粉、非淀粉多糖和蛋白质等，产生发芽所需要的小分子糖和氨基酸等营养物质[5-6]。γ-氨基丁酸（γ-amiobutyric acid，GABA）是其中比较典型的一种，也是评价发芽糙米营养价值的重要指标之一。GABA是一种非蛋白组成氨基酸，广泛分布于动植物体内，对人体具有重要的生理功能，如抑制性神经递质、调节血压和改善心血管等[7-8]。GABA对糙米发芽的具体作用尚不清楚，其合成主要是谷氨酸脱羧酶以谷氨酸为底物脱去一个羧基转变而来[9]。糙米的发芽还可以提高糙米中总酚的含量，总酚包括多酚和单酚等化合物，是非常有效的抗氧化类物质，对人体有各种有益的生理作用[10]。除此之外，大分子有机化合物如纤维素等的适当分解也可以有效地改善糙米的食用品质[11]。

对于发芽糙米，目前研究较多的是通过调整糙米发芽工艺富集发芽糙米中的GABA。比如调节发芽时间、培养液中钙离子浓度、培养液酸碱度以及进行浸泡厌氧处理等方式均有益于GABA的富集[12-13]。相对来说，糙米预处理技术对糙米发芽及GABA富集的影响研究较少。

超声波技术在食品工业中的应用日益受到人们的关注。许多研究发现，超声波可以加快种子的萌发。Yaldagard等[14]研究发现低频率的超声波处理可以提高大麦的发芽率并且提高了内源α-淀粉酶的活性。Goussous等[15]同样利用超声波处理鹰嘴豆、小麦、胡椒和西瓜种子，发现低频率超声波对这4种种子的发芽都有促进作用。张瑞宇[16]研究了超声波处理对糙米发芽生理特性的影响，得出超声波处理可以提高淀粉酶的活力，提高糙米发芽的呼吸强度。郑艺梅等[17]研究了超声波处理对发芽糙米主要成分的影响，得出超声波处理可以提高可溶性蛋白、游离氨基酸和GABA的含量。

除了超声波外，外源酶处理对种子的发芽也有一定的影响。Yambe等[18]利用组织浸解酶预处理玫瑰花种子，发现种子的发芽速率加快；张强等[19]利用纤维素酶预处理糙米，发现适当的酶解可以提高糙米发芽率，降低发芽糙米蒸煮后的硬度。

本研究结合超声波和外源酶对糙米进行预处理。在单因素试验的基础上，通过中心组合试验研究了超声波辅助酶预处理过程中超声温度、超声时间和酶质量浓度对糙米预处理后处理液中总糖含量（total sugar content，TSC）、糙米发芽率（germination percentage，GP）、GABA含量的影响以及相互之间的关联性，并比较了未经预处理和经预处理糙米发芽后理化特性的变化，可为发芽糙米的进一步加工利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稻谷由江苏农垦提供；纤维素酶（酶活力15 U/mg）、果胶酶（酶活力50 U/g） 国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JLGJ4.5型检验砻谷机 台州市粮仪厂；TP-214电子分析天平 丹佛仪器（北京）有限公司；722N-可见光分光光度计、pHS-3C精密数显pH计 上海精密科学仪器有限公司；JXFM110锤式旋风磨 上海嘉定粮油仪器有限公司；质构分析仪 英国Stable Micro System公司；RVA快速黏度仪 澳大利亚Newport Scientific仪器公司；101-3AS电热鼓风干燥箱 上海苏进仪器设备厂；HH-2数显电子恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；AS10200A超声波清洗器 天津奥特赛恩斯仪器有限公司；降落数值仪 瑞典Perten仪器公司；TM 3000台式扫描电镜、L-8900氨基酸分析仪 日本日立公司；电饭煲 广州美的生活电器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糙米的准备

稻谷经砻谷机砻出糙米，去除霉变糙米粒、杂质、未成熟粒和碎糙米粒，用聚乙烯自封袋封装保存在4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 超声波辅助酶处理糙米

每组称量糙米50 g，放入具塞锥形瓶中，用纯水洗涤3 次，然后用0.5%的次氯酸钠溶液消毒15 min，之后再用纯水洗涤3 次，按固液比1∶4（g/mL）添加酶溶液（磷酸盐缓冲液pH 5.0，纤维素酶与果胶酶按质量比1∶1混合），然后将具塞锥形瓶放入超声波清洗器中，用热水和冰块使超声温度控制在选定范围内，超声波处理的频率40 kHz、功率30 W。

1.3.3 单因素试验

超声温度为变量：将糙米样品浸泡于磷酸盐缓冲液（pH 5.0，固液比1∶4）中，在不同超声温度条件下（20、30、40、50、60 ℃）浸泡1 h；超声时间为变量：将样品浸泡于30 ℃的磷酸盐缓冲液（pH 5.0，固液比1∶4）中，经超声处理不同的时间（0、0.5、1.0、1.5、2.0 h）；酶质量浓度为变量：将样品浸泡在不同酶质量浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L，纤维素酶和果胶酶按质量比1∶1混合）的磷酸盐缓冲液中，30 ℃处理1 h。

1.3.4 中心组合试验设计

利用Design-Expert 8.0.5软件自带的中心组合试验模型，以超声温度（X1）、超声时间（X2）、酶质量浓度（X3）3 个因素为自变量，糙米预处理后处理液中TSC（Y1）、GP（Y2）、GABA含量（Y3）为响应值，依据单因素试验结果，设计了三因素三水平的响应面分析试验。利用Design-Expert 8.0.6软件进行数据拟合，利用SAS 9.2软件对数据进行相关性分析。

1.3.5 TSC测定和扫描电子显微镜分析

采用蒽酮比色法测定预处理后滤液中的TSC[20]。将糙米冷冻干燥，使水分含量低于5%，利用离子溅射器对糙米的表面进行喷金，在扫描电子显微镜下观察经超声波辅助酶预处理和未经预处理的糙米皮层的微观结构。

1.3.6 糙米的发芽

将预处理后的糙米浸泡在质量分数0.5%、pH 5.0的磷酸盐缓冲液（含0.25 mg/L氯化钙、0.05%次氯酸钠）中，30 ℃培养48 h进行发芽，然后将发芽后的糙米于40 ℃烘箱干燥24 h，使水分含量低于14%，用聚乙烯自封袋封装保存在4 ℃冰箱中备用。未经预处理的糙米作为对照。

1.3.7 GP的测定

糙米培养48 h后，根须长度大于0.5 mm计为发芽。发芽的种子数与种子总数的比值即为GP。

1.3.8 GABA含量的测定

样品的前处理依据钱爱萍等[21]的方法，利用氨基酸分析仪测定GABA的含量。

1.3.9 总酚含量的测定

利用Tabaraki等[22]的方法提取总酚，然后将1 mL提取液加入10 mL容量瓶中，再加入1 mL福林酚显色剂，摇匀后加入2 mL 15%的碳酸钠溶液，加纯水定容，室温条件下反应2 h后，于765 nm波长处测定其吸光度。用没食子酸做标准曲线与回归方程。

1.3.10 淀粉酶活性的测定

依据AACC 56—81B方法[23]，利用沉降系数判断淀粉酶活性的变化。

1.3.11 发芽糙米粉糊化黏度的测定

依据AACC 76—21方法[24]，利用快速黏度仪测定，并用TCW（thermal cline for windows）配套软件对数据进行记录与分析。检测发芽糙米粉的峰值黏度、谷值黏度、崩解值、最终黏度、回生值和峰值时间。

1.3.12 糙米蒸煮后的质构特性

称样品3 g，放于铝盒中，加入1.2 倍的蒸馏水，盖好盖后放入电饭煲中蒸煮，蒸煮30 min后，室温冷却至28 ℃，用质构仪检测糙米蒸煮后的质构特性，测试所选平台为圆形平台，P25（25.4 mm直径）探头，压缩比为60%，测前速率10.0 mm/s，测试速率0.5 mm/s，测后速率5.0 mm/s，两次压缩之间停留5.0 s，每组实验重复7 次。

1.4 数据分析

利用SAS 9.2数据分析工具对数据进行显著性差异分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

发芽是一种新陈代谢过程，植物细胞中的内源酶对糙米种子的萌发具有重要作用。在单因素试验中，超声温度对糙米GP的影响如图1A所示，随着超声温度从20 ℃上升到40 ℃，糙米的GP缓慢增加；而当超声温度继续升高时，糙米的GP显著降低（P＜0.05）。其原因可能是由于高温导致内源性酶失活，从而抑制了糙米的发芽。图1B显示了超声时间对糙米GP的影响，0～1.0 h GP显著增加（P＜0.05），1.0～2.0 h GP降低（P＜0.05）。Kim[25]和Suzuki[26]等报道，超声波可用于加快大麦和小麦等谷物种子的萌发，主要是由于它的空化效应可能加快种子内外营养素的交换，从而更快地激活种子内源酶的活性。Yaldagard[14]和Goussous[15]等也证实了低频超声对糙米GP具有一定的促进作用，并可以提高糙米内源性酶如α-淀粉酶的活性。但长时间暴露在超声波下，糙米的GP降低。Barton[27]和Wang Zhenbin[28]等报道，长时间高频率的超声波处理会导致一些糖苷酶和纤维素酶的失活，并且长时间暴露在超声波下，种子细胞壁也容易受到破坏。酶质量浓度对糙米GP的影响如图1C所示，随着酶质量浓度的增加，GP呈先升后降的趋势，可能是由于酶处理降解了糙米的皮层纤维素，有利于加速细胞内外营养物质的交换，提高 糙米的GP。Yambe[18]和张强[19]等报道了通过酶预处理可以促进种子的发芽。然而，过高的酶质量浓度可能会使纤维素皮层分解过度，甚至导致发芽所必需的营养物质外流[15]。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 中心组合试验设计与结果

如表1所示，用Design-Expert.8.0.5软件对试验进行回归拟合分析，得到TSC、GP和GABA含量与各因素变量的二次方程模型分别为：

123123.83－10.25X1X2－1.5X1X3－1.75X2X3

为了验证回归方程的有效性及各因素对响应值的影响程度，对回归方程进行了方差分析，结果见表2、3。

从表2可以看出，TSC的回归模型P值为0.010 0；GP回归模型P值为0.036 2；GABA含量的回归模型P值为0.006 3；P值均小于0.05，说明回归模型达到显著水平。3 个因素的各单次项对TSC影响均有显著水平，而交互项和平方项影响不显著。在所选的各因素水平范围内，按照对TSC结果的影响排序为：X3＞X2＞X1，即酶质量浓度＞超声时间＞超声温度。3 个试验因素中单次项的X1和X2及交互项的X1X2对GP有显著性影响，其他项对GP没有显著性影响。在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序为：X1＞X2＞X3，即超声温度＞超声时间＞酶质量浓度。由表3可见，失拟系数达到非显著水平，说明模型合适；TSC、GP和GABA含量的决定系数R2分别为0.923、0.876、0.934。说明了方程拟合度较高，即方程中自变量X的变化可以很好地解释因变量Y的变化。

2.2.2 响应面试验分析

由图2B1可见，在高温短时处理或低温长时处理条件下，GP可以达到90%以上；图2B2、B3表明，酶质量浓度对糙米GP影响较小，与其他因素也没有显著的交互作用。3 个试验因素中单次项超声温度和超声时间对GABA含量有显著性影响，而酶质量浓度X3对GABA含量的影响无显著水平；交互项X1X2、X2X3和平方项X12、X32对GABA含量影响均为显著性水平，交互项X1X3和平方项X22对GABA含量无显著性影响。在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序为：X2＞X1＞X3，即超声时间＞超声温度＞酶质量浓度；由图2C2、C3可见，酶质量浓度对GABA含量没有直接的影响，但是可以与超声温度、超声时间的交互作用来影响GABA的含量。从响应面分析来看，超声辅助酶预处理的温度和时间对糙米GP和GABA含量均有显著性影响，在较低超声温度（25 ℃）条件下，随着超声时间延长，GP增加，同时GABA的含量增加。但在较高超声温度（45 ℃）条件下，超声时间越长，GP和GABA含量均显著降低。酶质量浓度（外源添加）对糙米GP和GABA含量的影响不显著，但适当的酶促水解有利于糙米表层结构的降解，加快糙米内外的营养物质交换，从而提高糙米GP，促进GABA的积累。

2.2.3 扫描电镜图

由图3可以看出，未经预处理的糙米皮层纤维排列紧密，并且皮层表面有一层蜡质，可以有效地阻止水分的进入与散失；而预处理后的糙米皮层纤维素明显被降解，外层的蜡质层变薄，并且皮层上有一些微小的空洞，这样的形态变化可能有利于水分和培养液中营养素的进入。Goussous等[15]曾推断超声波可以使谷物的纤维素皮层变得松散，产生一些微小的空洞，通过本实验的电镜图可以清楚地看到这些微小的空洞，也证明了他们的推断。

2.2.4 试验因素的优化与相关性分析

等高线图确定了GP和GABA含量的预处理优化参数（图4）。当超声波辅助酶预处理时间0.71 h、超声温度31.21 ℃、酶质量浓度0.28 g/L时，GP最高预测值为91.98%。当超声时间0.5 h、超声温度35.65 ℃、酶质量浓度0.22 g/L时，GABA含量最高预测值为38.25 mg/100 g。表4表示了用SAS软件进行的3 个响应值（TSC、GP

和GABA含量）的相关性分析。GP和GABA含量具有一定的正相关性，相关系数为0.721。TSC与GP、GABA含量呈负相关性，相关系数分别为－0.644和－0.506。TSC可以间接地反映出不同的预处理条件对糙米纤维素皮层的分解程度，因此预处理工艺必须要适度控制对糙米纤维素皮层的分解程度，以有利于糙米发芽及GABA的富集。

2.3 超声波辅助酶预处理对发芽糙米理化特性的影响

表5为超声波辅助酶预处理（超声时间0.5 h、超声温度35.65 ℃、酶质量浓度0.22 g/L）对糙米及发芽糙米中GABA含量、总酚含量和淀粉酶活力的影响。可以看出，糙米经超声波辅助酶预处理后GABA含量没有发生变化，但是发芽后，经预处理工艺的发芽糙米中GABA含量远远高于未经预处理的，达到38.07 mg/100 g，接近响应面优化预测的最大值38.25 mg/100 g，而未经预处理的发芽糙米中GABA含量仅有31.88 mg/100 g。超声波辅助酶预处理对糙米总酚含量的有一定的负面影响，从表5中可以看出，糙米经超声辅助酶预处理后总酚含量有一定程度的下降。发芽后总酚含量仍低于未经预处理的发芽糙米中总酚含量。沉降系数可以间接反映出淀粉酶的活力，沉降系数越小淀粉酶的活力越大，反之，淀粉酶的活力越小[29-30]。从表5可以看出，超声波辅助酶预处理降低了糙米粉的沉降系数，因此可以间接地反映出预处理工艺提高了内源淀粉酶的活力。在糙米发芽后，经预处理工艺的发芽糙米淀粉酶活力远远高于未经预处理工艺的发芽糙米的内源淀粉酶活力。

表6为超声波辅助酶预处理对发芽糙米粉糊化黏度特性的影响。可以看出糙米经超声波辅助酶预处理后，糙米粉的峰值黏度、谷值黏度、最终黏度、崩解值、回生值和峰值时间均有所提高，而发芽后，经预处理工艺的发芽糙米粉峰值黏度、谷值黏度、最终黏度、峰值时间均略低于未经预处理工艺的发芽糙米粉的相同指标。表7为超声波辅助酶预处理对蒸煮后糙米和发芽糙米质构特性的影响。可以看出，预处理对糙米的蒸煮质构特性有显著影响。糙米经超声波辅助酶预处理后硬度、黏着性、胶黏性和咀嚼性均有所下降，而发芽后，经预处理工艺的发芽糙米的硬度、胶黏性和咀嚼性有更大程度的降低。

GABA含量是评价发芽糙米营养价值的重要指标，因此利用优化得到的预处理最佳试验条件处理糙米，发芽后，GABA含量可达38.07 mg/100 g，与预测值38.25 mg/100 g十分接近，可见所得模型能较好地预测超声波辅助酶预处理对GABA含量的影响，参数准确可靠，可用于实际操作。

从发芽糙米的理化特性来看，超声波辅助酶预处理首先有利于GABA的富集，但不利于总酚的积累。总酚包括多酚和单酚等化合物，广泛分布于植物组织中，易与细胞壁上多糖交联在一起，作为植物的次级代谢产物[31]。而超声波辅助酶预处理可能造成了细胞壁结构的破坏，减弱了总酚与细胞壁多糖的交联作用，导致总酚的流失。超声波辅助酶预处理可以提高发芽糙米内源淀粉酶的活性，加快发芽糙米淀粉等大分子有机物的分解，为糙米发芽提高物质与能量的支持。Yaldagard等[14]研究发现，低频率的超声波处理对α-淀粉酶有促进作用。 同时发芽糙米粉糊化黏度的变化也证实了这一点。糙米经超声波辅助酶预处理后，糙米粉的峰值黏度、谷值黏度、最终黏度、崩解值、回生值和峰值时间均有所提高，其原因在于纤维素在预处理过程中的部分分解，淀粉相对含量的提高增加了糙米粉的糊化黏度[32]，而发芽后，由于淀粉酶活性的提高，淀粉分解为小分子糖，糊化黏度迅速降低。糙米和发芽糙米蒸煮后的硬度变化同样反映了这一原理，发芽前，纤维素的分解，改变了皮层的形态，在蒸煮过程中水分和热量更容易进入到颗粒内部，淀粉颗粒也更容易膨胀[33-34]；发芽后，淀粉的快速分解造成了糙米饭硬度、胶黏性和咀嚼性的快速下降。

3 结 论

本研究结合超声波技术和外源酶对糙米进行预处理。在单因素试验基础上，通过中心组合试验研究了超声波辅助酶预处理过程中超声温度、超声时间和酶质量浓度对糙米预处理后处理液中TSC、糙米GP、GABA含量的影响以及相互之间的关联性。超声辅助酶预处理的超声温度和超声时间对糙米GP和GABA含量均有显著的影响，而酶质量浓度对糙米GP和GABA的影响不显著。通过响应面分析，GP优化预处理条件为超声温度31.21 ℃、超声时间0.71 h、酶质量浓度0.28 g/L，GP最高预测值为91.98%；GABA含量最佳预处理条件为超声温度35.65 ℃、超声时间0.5 h、酶质量浓度0.22 g/L时，GABA含量最高预测值为38.25 mg/100 g。相关性分析表明GP和GABA具有一定的正相关，相关系数为0.721。而TSC与GP、GABA含量呈负相关关系，相关系数分别为—0.644和—0.506。

从发芽糙米的理化特性来看，超声波辅助酶预处理有利于GABA的富集，但不利于总酚的积累。超声波辅助酶预处理可以有效地提高内源淀粉酶的活力，相应地降低发芽糙米的糊化黏度及蒸煮后的硬度。

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Effect of Ultrasound-Assisted Enzymatic Pretreatment on Germination of Brown Rice and Its Physicochemical Properties

LIU Junfei, TANG Xiaozhi*, HU Zhanqiang, DAI Feiyun, FANG Yong, HU Qiuhui
(Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

Ultrasound-assisted enzymatic hydrolysis was utilized for the pretreatment of brown rice. The 3-factor 3-level response surface analysis was designed using temperature, ultrasound processing time and enzyme concentration as the independent variables, and using total sugar content after brown rice pretreatment, brown rice germination percentage, and γ-amiobutyric acid (GABA) content of germinated brown rice as the response values through central composite design model. At the same time, the effect of pretreatment on the physicochemical properties of germinated brown rice such as GABA content, total content of phenols, amylase activity, gelatinization viscosity and texture characteristics of cooked rice was investigated. Results indicated that both processing temperature and time had significant effects on rice germination percentage and GABA content. Treatment time of 0.71 h, temperature of 31.21 ℃, and enzyme concentration of 0.28 g/L could result in the optimal germination percentage with the predicted maximal germination rate of 91.98%. The predicted maximal GABA content could be up to 38.25 mg/100 g after pretreatment for 0.5 h at 35.65 ℃ with an enzyme concentration of 0.22 g/L. Based on physical and chemical properties of germinated brown rice, the ultrasound-assisted enzymatic pretreatment is beneficial to the enrichment of GABA, but unfavorable to the accumulation of total phenols. This pretreatment could effectively enhance the activity of endogenous amylase, accordingly reducing the pasting viscosity of germinated brown rice and its hardness after cooking.

ultrasound; enzyme; germinated brown rice; physicochemical property

TS210.1

A

1002-6630（2015）04-0011-08

10.7506/spkx1002-6630-201504003

2014-04-01

“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD34B08）；江苏高校优秀科技创新团队项目（苏教科[2013]10号）

刘俊飞（1993—），男，硕士研究生，研究方向为粮油食品精深加工。E-mail：282852370@qq.com

*通信作者：汤晓智（1977—），男，教授，博士，研究方向为粮油食品精深加工。E-mail：warmtxz@njue.edu.cn