超声波辅助复合酶提取菊糖工艺优化

范三红，李 静，王亚云，胡雅喃

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

超声波辅助复合酶提取菊糖工艺优化

范三红，李 静，王亚云，胡雅喃

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

以菊芋块茎为原料，采用超声波辅助复合酶酶解法进行菊糖提取工艺研究。首先通过单因素试验和Plackett-Burman筛选试验确定菊糖提取工艺中影响显著的3 个因素——超声温度、超声时间和加酶量，再利用Box-Behnken试验及响应面分析法优化最佳提取工艺条件。结果表明：最佳提取工艺条件为料液比1∶20（g/mL）、超声温度51 ℃、加酶量120 ☒g/g（m（果胶酶）∶m（纤维素酶）=1∶4）、超声时间25 min、pH 5.5，优化后菊糖得率为72.2%。

超声波；复合酶；菊糖；响应面

菊芋（Helianthus tuberosus L.）俗名洋姜、鬼子姜，属多年生菊科向日葵属，为食用地下块茎的薯芋类蔬菜[1]。菊糖在菊芋中占有很大比例，它是一种聚合度2～60的混合物[2]。菊糖有很多功能性作用，如预防糖尿病人的低血糖以及促进肠道双歧杆菌的生长，因此可以作为糖、脂肪替代物[3]而大量用于低热量、低糖、低脂肪食品中，并能显著改善无脂或低脂食品的口感[4]和质感,不仅如此，菊糖还具有促进矿物质吸收[5]和制备低聚果糖、超高纯度果糖浆[6-7]等功能。研究[8-9]表明，每日摄食2 g菊糖对控制人体的质量、改善肠道功能、防止机体失调以及老年性疾病很有帮助。因此，菊糖已被世界上40多个国家批准为食品的营养增补剂。

目前，菊糖的提取主要采用热水浸提法，该方法提取菊糖不仅提取率很低，而且耗时长，并且长时间的高温加热容易破坏菊芋中其他的活性成分。鉴于传统的热水浸提法存在的这些缺点，很有必要找到一种耗时少、操作方便且提取率高的实验方法。采用超声波辅助酶法提取菊糖，这种方法耗时短，而且超声波的强烈振动以及空化效应可以使有效成分迅速进入溶剂，从而有利于菊糖的提取。本实验在单因素试验的基础上，采用响应面优化菊糖的提取条件，从而为菊糖的工业生产提供理论依据[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菊芋 山西省汾阳市品种；C8260-1纤维素酶R- 10（10 U/mg）、P8180-100果胶酶（40 U/mg） 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TG16A-WS高速离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；奥立龙MODEL868酸度计、SP-2000UV型紫外分光光度计 上海光谱有限公司；AL204型电子分析天平 上海良平仪器仪表有限公司；HH-4恒温水浴锅浙江国华电器公司；SP-040ST超声波清洗机 广州洁盟超声波设备有限公司；XF50实验室粉碎机 吉首市中诚制药机械厂。

1.3 方法

1.3.1 可溶性总糖含量的测定

以葡萄糖为标准，采用蒽酮比色法在620 nm波长处测定吸光度，带入葡萄糖标准曲线（回归方程y=0.006 5x—0.035 7，R2=0.999 0），求出总糖质量，按式（1）计算菊芋中可溶性总糖含量[11]。

式中：C为在标准曲线中查出的糖含量/μg；V总为提取液的总体积/mL；V测为测定时取用液体体积/mL；D为稀释倍数；M为样品质量/g。

1.3.2 还原糖含量的测定

以葡萄糖为标准，采用3,5-二硝基水杨酸比色法在540 nm波长处测定吸光度，带入葡萄糖标准曲线（回归方程y=0.930 5x—0.038 73，R2=0.999 2），求出还原糖质量，按式（2）计算菊芋中还原糖含量[12]。

1.3.3 提取工艺流程

菊芋块茎→切片→50 ℃烘干→粉碎→过80 目筛→样品→超声波辅助复合酶酶解→灭酶10 min→过滤→上清液（粗提液）

1.3.4 复合酶比例的筛选

准确称取果胶酶和纤维素酶，使其质量比分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，配制成0.1 mg/mL的复合酶酶解液，离心，取上清液放置4 ℃冰箱中备用。

分别称取一定量的菊粉，加入2 mL上述配制好的复合酶酶解液，再加入等体积的蒸馏水，在超声功率240 W、超声温度50 ℃的条件下超声30 min，按式（3）计算菊糖得率。

1.3.5 菊糖粗提液提取的单因素试验

采用控制变量法，分别研究料液比、pH值、超声温度、超声时间、加酶量5 个因素对菊糖得率的影响[13]。

1.3.5.1 料液比对菊糖得率的影响

固定超声功率240 W、超声温度40 ℃、pH 5.5、加酶量40 ☒g/g，在料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）条件下超声提取20 min，90℃灭酶10 min，过滤，测定上清液中总糖和还原糖的含量，计算上清液菊糖得率。

1.3.5.2 pH值对菊糖得率的影响

固定超声温度40 ℃、加酶量40 ☒g/g、料液比1∶20（g/mL），pH值分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5条件下超声提取20 min，90 ℃灭酶10 min，过滤，计算上清液中菊糖得率。

1.3.5.3 超声温度对菊糖得率的影响

固定pH 5.5、加酶量40 ☒g/g、料液比1∶20（g/mL），超声温度分别为35、40、45、50、55 ℃条件下超声提取20 min，90 ℃灭酶10 min，过滤，计算上清液中菊糖得率。

1.3.5.4 声时间对菊糖得率的影响

固定超声温度50 ℃、pH 5.5、加酶量40 ☒g/g、料液比1∶20（g/mL），超声时间分别为10、15、20、25、30 min条件下提取，90 ℃灭酶10 min，过滤，计算上清液中菊糖得率。

1.3.5.5 加酶量对菊糖得率的影响

固定超声温度50℃、pH 5.5、料液比1∶20（g/mL），加酶量分别为0、40、80、120、160 ☒g/g条件下超声提取25 min，90 ℃灭酶10 min，过滤，计算上清液中菊糖得率。

1.3.6 Plackett-Burman筛选试验设计

在单因素基础上，对五因素进行因素筛选试验，确定显著影响因素。

1.3.7 响应面试验设计

在单因素试验和Plackett-Burman筛选试验的基础上，对所确定的因素进行Box-Behnken试验，确定最佳菊糖提取工艺参数。

2 结果与分析

2.1 复合酶比例的筛选

从图1可以看出，当m（果胶酶）：m（纤维素酶）为1∶4时，菊糖得率最高。当其质量比为1∶5时，菊糖得率会减小。这是可能因为当纤维素酶质量浓度增加到一定程度时，使得酶活性降低，对纤维素的酶解能力减弱，导致菊糖得率降低[14]。所以选择复合酶（果胶酶和纤维素酶）质量比为1∶4。

2.2 菊糖粗提液提取的单因素试验结果

2.2.1 料液比对菊糖得率的影响

从图2可以看出，料液比为1∶10（g/mL）时，菊糖得率最低，当料液比为1∶20时菊糖得率达到最高，之后随着溶剂用量的增加，菊糖含量反而下降。因为随着溶剂用量的增大，溶液中底物和酶的质量浓度也随之下降，有效反应碰撞减少，所以最佳料液比为1∶20（g/mL）。

2.2.2 pH值对菊糖得率的影响从图3可以看出，pH 5.5时，菊糖得率最高，因为pH 5.5可能是复合酶的最适pH值，当pH值增大后，改变了酶的空间构象[15]，从而使酶的活性下降。

2.2.3 超声温度对菊糖得率的影响

从图4可以看出，随着超声温度的升高，菊糖得率也随着增大，在超声温度为50℃时，菊糖得率达到最大，当温度进一步升高后，菊糖得率却急剧下降。这是因为温度升高，使复合酶失活，从而导致菊糖得率下降[16-17]。

2.2.4 超声时间对菊糖得率的影响

从图5可以看出，超声时间为25 min时菊糖得率最高，超声时间低于25 min时，菊糖含量随着超声时间的延长而增大，当大于25 min时，菊糖得率反而下降，可能因为多糖在较长超声时间条件下遭到破坏[18]，分解成单糖。

2.2.5 加酶量对菊糖得率的影响

从图6可以看出，菊糖得率随着加酶量的增加而增大，当加酶量为120 ☒g/g时，菊糖得率随着加酶量增大而变得缓慢，可能因为此时酶的用量在底物质量浓度一定的情况下已经达到饱和，当酶用量增大时，菊糖得率变化很小，所以加酶量为120 ☒g/g时为最佳。

2.3 Plackett-Burman试验显著影响因素的确定

2.3.1 试验设计处理及响应值

在单因素试验的基础上，对5 个因素（料液比、超声温度、加酶量、pH值、超声时间）利用Minitab15.0软件进行Plackett-Burman试验设计和数据分析，以菊糖得率为响应值，见表1。

2.3.2 关键影响因素的确定

利用Minitab 15.0软件对试验结果进行分析，得到回归模型方差分析，见表2。

由表2可知，主效应的P=0.001＜0.05，决定系数R2=94.32%，说明试验所得的拟合回归方程达到显著性（模型）；校正决定系数R2Adj=89.59%，表明89.59%的数据变异可以用此回归方程来解释，因此可以较好地确定关键影响因素。

由表3可知，因素X2、X3的P值小于0.01，说明这两个因素对试验具有极显著的影响，因素X5的P值小于0.05，则说明其对试验有显著性影响，因此，在菊糖提取试验中，显著影响因素为超声温度、加酶量、超声时间。故在下一步响应面分析中，重点考察超声温度、加酶量和超声时间的最优水平范围。

2.4 响应面试验设计对最佳工艺条件的确定

2.4.1 Box-Behnken试验设计与结果

利用Minitab 15.0软件对菊芋中菊糖得率进行响应面设计，表4为响应面设计与结果，其中1～12为析因试验，13～15为中心点重复试验。

对表4中数据进行回归分析，得到菊芋中菊糖得率对超声温度、加酶量、超声时间的三元二次回归方程为：

Y=—3.155 4X22—5.082 9X3

2—15.655 4X5

2+

1.325 0X2X3+4.432 5X2X5—1.365 0X3X5+1.553 8X2—0.640 0X3+0.953 7X5+72.553 3

由表5可知，本试验所选的三元二次回归模型具有较好的显著性（P＜0.001），各因素对菊糖得率不是简单的线性关系（P＞0.05），平方项和交互作用对该模型具有显著性（P＜0.05），说明这两项对响应值有极大的影响，决定系数R2=98.38%，校正决定系数=95.45%,说明该模型能解释95.45%响应值的变化，从失拟项P=0.057＞0.05（不显著），说明可以利用该回归方程确定最佳菊糖的提取工艺。

从回归系数显著性分析（表6）可以看出，X22对菊糖得率的影响具有显著性（P＜0.05），X32、X52、X2X5对菊糖得率的影响具有极显著性（P＜0.01），说明在该试验中，超声温度、加酶量、超声时间对菊糖得率有显著性影响，而从X22、X32、X52、X2X5也可以看出，它们对菊糖得率的影响是非线性的。

2.4.2 响应面分析与优化

根据上述二次多项回归方程作出的响应面图和等高线图，可以直观地看出超声温度，加酶量、超声时间对菊糖得率的影响，如图7～9所示。

从图7可以看出，加酶量和超声温度的交互作用对菊糖得率影响不显著，加酶量110～130 ☒g/g、超声温度48～53 ℃时，菊糖得率有最高点。由图8可以看出，超声时间和超声温度的交互作用对菊糖得率影响显著，超声时间23～27 min、超声温度43～55 ℃时，菊糖得率有最高点。由图9可以看出，加酶量与超声时间的交互作用对菊糖得率影响也显著，超声时间22～28 min、加酶量100～140 ☒g/g时，菊糖得率有最高点。

综合图7～9，三因素对菊糖得率的影响以及各因素的交互作用与回归分析一致。利用Minitab15.0中的相应优化器可以得出菊糖得率最大时超声温度、加酶量、超声时间的预测工艺，即超声温度51.46 ℃、加酶量118.79 μg/g、超声时间25.35 min，菊糖最大得率预测值为72.82%。

2.4.3 超声波辅助复合酶工艺条件的验证及确定

验证模型预测的准确性，考虑到操作可行性及方便性，将修正最佳提取条件为：超声温度51 ℃、加酶量120 ☒g/g、超声时间25 min。按此条件进行提取实验，实验重复3 次。得到的菊糖得率为72.2%、72.1%、72.2%，平均菊糖得率为72.2%，与预测值较接近，说明该模型能较好地预测超声波辅助复合酶提取菊糖的实际提取效果，具有实际应用价值。

3 结 论

在单因素试验的基础上，通过Plackett-Burman筛选试验、Box-Behnken试验设计以及响应面分析法对菊糖的提取工艺进行了优化，确定了加酶量、超声温度、超声时间为最佳菊糖提取的显著影响因素，即最佳工艺条件为超声温度51 ℃、加酶量120 ☒g/g、超声时间25 min，在此条件下，菊糖得率为72.2%。

近年来，酶工程技术被广泛应用于植物中活性物质的提取，因为植物细胞壁主要是由纤维素、果胶、半纤维素等组成，利用合适的酶，可以使提取条件温和，不易破坏其他活性成分。所以本实验主要采用纤维素酶和果胶酶破坏细胞壁成分，使糖类物质易于溶出，同时结合超声波，利用超声波的机械作用进而加速细胞壁的破裂，促进菊芋中菊糖的快速溶出，缩短了提取时间。超声波辅助复合酶提取多糖的方法，在菊糖提取方面还没有涉及，但在双孢菇多糖[19]、半边莲多糖[20]的提取上已有了研究，与传统方法[21]相比，该法在菊糖得率上分别提高了13.9%、70.6%，同时在提取时间与温度上也有了明显的缩短与降低。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Enzymatic Extraction of Inulin by Response Surface Methodology

FAN Sanhong, LI Jing, WANG Yayun, HU Ya’nan
(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

Inulin was ultrasonically extracted from jerusalem artichoke tubers by enzymatic hydrolysis with both pectinase and cellulase. By using single factor and Plackett-Burman designs, temperature, ultrasonication time and enzyme dosage were found to be significant factors influencing the extraction process. The three factors were further optimized by response surface methodology with Box-Behnken design. The results showed that the optimal extraction conditions were determined as a material-to-liquid ratio of 1:20 (g/mL), an extraction temperature of 51 ℃, a total enzyme dosage of 120 ☒g/g with m (pectinase):m (cellulase) ratio = 1:4, an ultrasonic treatment time of 25 min, and a pH of 5.5. Experiments conducted under these conditions gave an inulin yield of 72.2%.

ultrasonic treatment; complex enzyme; inulin; response surface methodology

TS218

A

1002-6630（2015）04-0023-06

10.7506/spkx1002-6630-201504005

2014-07-01

山西省自然科学基金项目（2012011031-4）；山西省高等学校高新技术产业化项目（20111003）

范三红（1963—），男，副教授，硕士，研究方向为食品科学。E-mail：fsh729@sxu.edu.cn