箭竹多糖理化分析及对肿瘤抑制作用研究

黄 伟，张志发，杜俊峰*，孙超超，魏 衡，唐 超

(1.武汉大学 药学院，湖北 武汉 430071；2.华中科技大学 同济医学院，湖北 武汉 430030； 3.杭州市中医院，浙江 杭州 310007；4.湖北新华医院，湖北 武汉 430015； 5.湖北省茶叶精深加工工程技术研究中心，湖北 宜昌 443100)



箭竹多糖理化分析及对肿瘤抑制作用研究

黄 伟1，张志发2，杜俊峰2*，孙超超3，魏 衡4，唐 超5

(1.武汉大学 药学院，湖北 武汉 430071；2.华中科技大学 同济医学院，湖北 武汉 430030； 3.杭州市中医院，浙江 杭州 310007；4.湖北新华医院，湖北 武汉 430015； 5.湖北省茶叶精深加工工程技术研究中心，湖北 宜昌 443100)

从箭竹中纯化制备多糖，获得纯化的箭竹多糖组分FP(fargesia polysaccharides )。FP的总多糖含量为90.77%,蛋白质含量为5.81%，分子量180904。IR分析表明FP为典型的碳水化合物；化学成分分析表明，FP为一种结合蛋白肽的多糖复合物。FP对人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2均具有显著抑制作用，呈现剂量效应，且FP对HepG2的抑制效果总体上强于K562。FP的高、中、低剂量组对小鼠S180 肉瘤均具有显著抑制作用(P<0.01或P<0.05) , 且呈现剂量效应。

箭竹；多糖；肿瘤；抑制作用

竹叶在我国具有悠久的药、食两用历史，我国的竹林资源约占全国森林总面积的3%，占世界竹林总面积的25%[1]。箭竹(fargesia)是我国竹叶的主要品种之一，为多年生地下茎匍匐竹类，主要分布于四川、云南及湖北等地[2]。箭竹林地面积大、资源丰富，但因其秆小，作为传统竹材加工使用受到限制。箭竹有效成分的提取及利用可为箭竹资源的深入开发提供新途径。

竹叶中除含有黄酮类功效成分外，多糖亦是其重要的天然活性物质，目前关于箭竹多糖的研究较少。本工作开展了箭竹多糖的理化特性及抗肿瘤活性研究，为其大规模生产制备及深加工终端产品的开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及主要仪器

箭竹，产自四川凉山。SPF级昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，购自南京生物医药研究院。SHIMADZU UV-2550紫外-可见分光光度计，Nicolet-170X 红外光谱仪，Agilent 1200系列高效液相色谱仪(HPLC)，蒸发光散射检测器(ALLTECH ELSD 3300)，美国ALLTECH公司；TSK-GEL G3000PWXL，TOSOH公司；Thermo Trace2000气相色谱仪、毛细管柱Rtx-5MS (30m×0.32mm i.d.)，美国Thermo Finnigan公司；Thermo Scientific Series 8000细胞培养箱。 Dextran Standard T系列标准品，Pharmacia公司；bradford法蛋白测定试剂盒，碧云天公司。其它试剂为国产分析纯。

1.2 箭竹多糖纯化制备及化学成分分析

取箭竹叶500g加水4 000mL，机械搅碎，沸水煎煮,过滤，Saveg法去蛋白质,活性炭脱色，乙醇沉淀,冷冻干燥, 得6.88g黄色粉末，为箭竹粗多糖CFP(Crude fargesia polysaccharides )。将箭竹粗多糖CFP 溶于水,经DEAE-纤维素DE32离子交换柱层析纯化，获得箭竹多糖纯化组分，经水透析、冻干后得浅黄色絮状粉末为箭竹多糖FP (fargesia polysaccharides)。

采用蒽酮-硫酸法测定箭竹多糖FP糖含量[3]；Bradford法测定FP的蛋白质含量[4]；糖腈乙酸酯衍生法测定FP单糖组成[5]。

1.3 分子量测定

箭竹多糖的分子量测定采用高效液相凝胶渗透色谱法(HPGPC)-蒸发光散射检测器(ELSD)分析，以Dextran Standard T系列葡聚糖T-10，T-40，T-70，T-500和T-2000(分子量分别为:10 000，40 000，70 000，500 000和2 000 000)作为标准品，以标准品重均相对分子质量对数lgMr与其HPGPC-ELSD色谱的保留时间tR做标准曲线，获得线性回归方程。

1.4 红外光谱测定

取3.0mgFP经适量溴化钾压片,采用 Nicolet-170X 红外光谱仪于4 000cm-1～400cm-1区间扫描。

1.5 FP对肿瘤细胞体外抑制作用

K562细胞和HepG2细胞分别培养于RPMI-1640培养基，培养基含青霉素100IU/mL，链霉素100U/mL，10%新生胎牛血清(56℃、30min灭活)，置饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱培养。

取对数生长期的上述肿瘤细胞分别用胰蛋白酶消化，再接种于96孔板, 实验组各孔加入终浓度为400、200、100、50μg/mL的FP。阴性对照每孔加入同体积的RPMI1640培养基,各组均设3个复孔, 于37℃,5%CO2培养箱培养48h后,加入MTT,继续培养4h后测定A570nm,细胞生长抑制率IR(%)=(1-实验组A570nm/对照组A570nm)×100%。

1.6 对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

选取体重18～22g昆明种小鼠,雄性，于右腋皮下接种S180细胞悬液(5.0×107个/mL)0.18mL/20g, 接种24h后随机分组, 每组10只。荷瘤对照组：给予等量生理盐水；FP剂量组：分为高、中、低剂量组，各组分别灌胃60、120和240mg/kg·d剂量FP多糖试样；阳性对照组：腹腔注射给予5-氟尿嘧啶(5-FU )120mg/kg·d。各组连续给药10天，给药结束后，次日以颈椎脱臼法处死小鼠,解剖剥取瘤块称重；解剖剥取胸腺、脾脏称重。分别按下列公式计算肿瘤抑制率和胸腺、脾脏的脏器指数。抑瘤率(%)=[(荷瘤对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)]/荷瘤对照组平均瘤重×100%；脏器指数(mg/g)=脏器重量(mg)/体重(g)，计算胸腺、脾脏指数。

2 结果与分析

2.1 箭竹多糖纯化组分FP化学成分及分子量

蒽酮硫酸法测得纯化组分的FP总多糖含量为90.77%,蛋白质含量为5.81%。箭竹多糖为一种结合蛋白肽的多糖复合物。GC分析表明箭竹多糖FP的多糖部分由6种单糖组成(见表1)，分别为葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖组成。各单糖组成的摩尔比表明FP以葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖为主，占总糖组成的80%以上。HPGPC-ELSD测得FP的相对分子量为180904。

表1 箭竹多糖FP单糖组成及摩尔比

2.2 红外光谱分析

红外光谱分析结果见图1。FP在3 417、2 924、2 854、1 649、1 419、1 384、1 077、547和471cm-1等具有特征吸收峰。其中3 417cm-1为O-H的伸缩振动；2 924cm-1和1 419cm-1分别为C-H伸缩振动和弯曲振动特征吸收；1 649cm-1左右的大峰是H2O的峰，表明FP易吸水；1 077cm-1处特征吸收由C-O-C伸缩振动引起。547cm-1和471cm-1两个吸收峰是含有多羟基化合物的缔合羟基弯曲振动吸收峰。官能团的红外光谱特征吸收分析结果表明，FP为典型的碳水化合物。

2.3 FP对K562和HepG2细胞抑制作用

细胞实验结果表明，箭竹多糖纯化组分FP对人白血病细胞K562和人肝癌细胞HepG2均具有显著抑制作用，且呈现剂量效应。当浓度达到200μg/mL以上时，FP对K562和HepG2的抑制率可达30%以上；随着浓度增加1倍，FP对K562和HepG2的抑制率接近或达到50%。FP在培养基中的浓度提高到500μg/mL，其对此两种细胞的抑制作用达到60%左右。FP对HepG2的抑制效果总体上强于K562。

2.4 FP对小鼠肉瘤S180抑制作用

与荷瘤组比较，FP高、中、低剂量组对小鼠S180 肉瘤均具有显著抑制作用(P<0.01或P<0.05) ,且呈现剂量效应，随着剂量的加大，FP对对荷瘤小鼠S180肿瘤的抑制率由23.55%提高到66%以上。高剂量组的抑瘤率与5-Fu药物组相当，见表3。

图1 箭竹多糖FP的红外光谱

组别剂量(μg/mL)抑制率(x±s，%)K562HepG2000FP⁃50507．32±0．258．45±0．36FP⁃10010011．31±0．6216．44±0．52FP⁃20020032．69±0．8830．76±0．48FP⁃40040047．27±1．2150．83±1．11FP⁃55050058．91±1．0964．24±2．17

表3 FP对S180小鼠肉瘤抑制作用

注:与荷瘤对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

2.5 FP对S180小鼠免疫器官的影响

由表4可知，FP高剂量组的脾指数是荷瘤对照组的2.8倍，胸腺指数是荷瘤对照组的1.8倍，中、高剂量组与荷瘤对照组比较均差异显著(P<0.01)。表明FP对S180荷瘤小鼠的脾脏和胸腺均具有促生长作用，且呈剂量效应推测FP对小鼠免疫增强作用与其抑瘤作用具有相关性。

3 结论

本研究表明，箭竹多糖为一种结合蛋白的杂聚多糖复合物，所获得的箭竹多糖组分的分子量为180 904。细胞和动物水平研究均表明，箭竹多糖具有显著的抑制肿瘤作用，且呈现剂量效应，这与其免疫增强功能相关。箭竹多糖的功能活性是其开发利用的基础，对其理化特性的系统研究可为批量生产制备提供指导。

表4 FP对S180荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响 (±s)

注:与荷瘤对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。

[1] 王文渊.竹叶黄酮的功能研究进展[J].中国食物与营养,2012,18(6):71-74.

[2] 胡毅，向卫国，朱克云，等.汪万江箭竹生长及开花的气象条件研究[J].成都气象学院学报，1997,12(3)：225-233。

[3] 张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 第2版.杭州: 浙江大学出版社, 1999.

[4] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding[J].Anal Biochem，1976(72)：248-254.

[5] 周鹏,沈金灿,谢明勇,等.GC-MS法分析茶叶中提取物TGP的单糖组成及机理探讨[J]. 厦门大学学报：自然科学版，2003，42(2)：213-217.

(责任编辑：魏 晓)

2014-11-13

黄伟(1981-)，男，武汉大学硕士研究生，主管药师，研究方向药物成分分析及药理学。

杜俊峰(1975-)，男，华中科技大学同济医学院医师，研究方向为营养与健康。

R285

A

1673-2197(2015)07-0039-03

10.11954/ytctyy.201507018