游泳对攻击行为大鼠肾脏形态及HSP70表达的影响

胡柏平，汪晓瑞，夏敏慧

（1陕西师范大学 体育学院，陕西 西安710119；2海南师范大学 体育学院，海南 海口571158）

应激作为机体对外界环境变化的综合应答反应，能保护细胞正常代谢，但若超过机体所能承受的应激反应域，则机体代谢会发生异常改变，使细胞受损直至影响正常生理功能。目前，运动干预应激损伤的研究备受关注。已有研究显示，中低强度的运动方式能够使机体产生良好的适应性变化，提高机体抵抗各种刺激的能力［1－2］。

攻击行为属于应激性负情绪，对社会发展具有严重的危害性。自杀未遂的青少年犯罪者都有较高的攻击性和冲动性［3］，而运动干预可以有效改善和降低攻击行为［4］。无论是攻击性评价还是行为学实验均显示，中等强度的运动能够有效地降低攻击行为；但是在降低攻击行为的同时，是否也降低了个体组织器官的应激损伤则鲜有报道。本文从降低应激反应程度以及减少应激造成的机体损伤方面，探索运动拮抗攻击性应激对机体组织器官的保护作用。热休克70kDa蛋白 （Heat shock 70kDa protein，HSP70）是分子量约70kD的热休克蛋白，是热休克蛋白家族中重要的一员，被称为主要热休克蛋白。HSP70对应激很敏感，是一种应激保护蛋白，其过高表达预示着应激对组织器官造成损伤。因此，本文通过定量分析游泳干预攻击行为大鼠，观察其肾脏形态及HSP70的表达，探索游泳对应激损伤的保护作用及其可能机制，为运动干预降低攻击行为及其对肾脏损伤的保护机制的探讨提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

Sprague－Dawley健康雄性大鼠42只，西安交通大学医学院实验动物中心提供。随机分为5组：安静对照组（A组）8只，群居游泳组（B组）8只，攻击对照组（C组）8只，攻击游泳组（D组）8只，入侵组（E 组）10只。

1.2 实验方法

1.2.1 攻击模型建立 采用单笼饲养和入侵鼠攻击建立攻击模型［5－7］。单笼饲养20d，第21天开始，电刺激入侵鼠使其具有攻击性用以攻击单笼饲养鼠，使其产生攻击行为，依据攻击行为评定分值判定是否成功诱导了攻击性。

1.2.2 训练方案 水深高度随着大鼠身长的增长从40cm逐渐增加到55cm，水温32～34℃，适应性训练4d后，增加训练时间至20min；一周后，增加训练时间至30min；四周后直至90min。群居游泳组每周一、二、三、五、日训练，攻击游泳组训练前先进行情绪激惹，每周一、二、三、五、日进行训练，共训练8周，具体如表1所示。

表1 游泳训练负荷安排Tab.1 The load of the swimming training min

1.3 指标测试

1.3.1 HE染色 二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度的酒精处理，之后入蒸馏水，染色，脱水透明，最后封固。

1.3.2 免疫组化染色 选择片子脱蜡至水，在3%H2O2放置10min，蒸馏水中洗，将片子放在柠檬酸盐缓冲液（CB）中，一同放入微波炉，中火加热至沸腾，间隔5min，再中火加热至沸腾，拿出至冷却，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗，在组织上滴加封闭液，室温放置30min，然后甩去多余的液体，滴加一抗，置于4℃冰箱过夜，拿出片子，复温30min，用PBS洗，滴加二抗，37℃，放置30min，用PBS洗，滴加链霉亲和素－生物素复合物（SABC），二氨基联苯（DAB）显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。

1.3.3 Western Blot实验方法 取样本的冰冻组织，用细胞裂解缓冲液（RIPA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）提取肾脏组织的总蛋白，然后对样本蛋白进行定量。等量的蛋白质用聚丙酰胺凝胶电泳进行分离，电泳结束后，将蛋白转至硝酸纤维素膜（NC）上，用丽春红进行染色，之后用蒸馏水洗，再进行封闭，40min后，孵育一抗，室温放置30min后，放4℃冰箱过夜，复温30min后，用Tris－HCl缓冲盐溶液（TBST）洗5min×5次，孵育二抗，40min后用TBST洗5min×5次，用化学发光底物发光。

1.4 统计学分析

Western Blot实验结果用Image J进行灰度分析，所有数据均用GraphPad Prism软件进行分析。实验数据以平均数±标准差（X±SD）表示，用多因素方差分析进行多重比较，P＜0.05水平为差异显著，P＜0.01水平为差异非常显著。

2 实验结果

2.1 肾脏组织学染色

各组大鼠肾脏苏木精—伊红染色（HE）结果显示（见图1），安静对照组和群居游泳组大鼠肾皮质区结构清晰，肾小球以及肾小管结构基本正常；与安静对照组相比，攻击对照组与攻击游泳组大鼠肾脏均出现不同程度的形态学改变，主要显示肾小球肥大并伴有淤血现象，肾小管上皮细胞出现水肿，部分管腔扩张，部分肾小管上皮细胞出现空泡样变性，管腔中有少量脱落的上皮细胞及绒毛。与攻击对照组相比，攻击游泳组大鼠肾小球淤血现象和肾小管内的脱落细胞有所减少。

图1 各组大鼠肾小球HE染色结果Fig.1 The HE staining of glomerular in each group

2.2 肾脏HSP70免疫组织化学染色

光镜下观察各组大鼠肾皮质区和髓质区HSP70免疫组织化学染色。结果显示，攻击对照组与攻击游泳组均可见不同程度的阳性表达区域，呈棕黄色，形态多样，主要分布在肾小球毛细血管内皮细胞的胞浆以及肾小管上皮细胞的胞浆和胞核附近（见图2）。安静对照组和群居游泳组在肾小球和肾小管附近有少量的阳性表达，呈不规则形状。与攻击对照组相比，攻击游泳组大鼠肾小球部分表达有所减少。

图2 各组大鼠肾小球HSP70免疫组织化学染色结果Fig.2 The immunohistochemical staining expression of HSP70

2.3 肾脏HSP70Western Blot检测

Western Blot检测结果（如图3所示）显示，HSP70蛋白表达群居游泳组低于安静对照组（P＜0.01），攻击对照组显著高于安静对照组（P＜0.01），攻击游泳组显著低于攻击对照组（P＜0.01）。双因素方差分析显示，游泳运动和攻击性应激的交互作用对大鼠肾脏HSP70蛋白的表达产生显著影响。

图3 HSP70蛋白的Western Blot结果Fig.3 The Western Blot expression of HSP70＊.P＜0.05与 A组比较；＊＊.P＜0.01与 A组比较；＊＊＊.P＜0.01与A组比较；＃＃＃.P＜0.01与C组比较。

3 分析与讨论

3.1 各组大鼠肾脏形态学改变的生物学分析

肾脏对缺血及缺氧异常敏感，而大强度运动后机体交感神经兴奋，儿茶酚胺分泌增加，血液重新分配，肾脏血管收缩，血液黏稠度增加，进而影响肾脏的血流量。而肾脏血流量减少及细胞内钙离子的增加等会导致细胞的水肿以及变性。大强度运动中的缺血再灌注可通过线粒体，花生四烯酸等多种途径诱导自由基的产生［8］，进而攻击肾脏的脂质膜结构，改变细胞的通透性，使细胞发生水肿，影响肾脏的功能。而耐久性运动可通过提高肾脏超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）的活性，提高肾脏抵抗过强自由基的侵蚀能力［9］。

本实验显示，中等强度的群居游泳组未出现肾皮质区以及肾小管的结构改变，提示中等负荷游泳运动使机体产生良好的适应。可能是由于中低强度的运动提高了机体各器官组织的功能，使机体代谢能力增强，提高了清除代谢废产物的能力，使机体自由基处于较低状态，保护了组织器官，使肾脏的适应机制增强。长期中等强度游泳运动也能提高机体的心肺功能，提高氧的运输、摄取和利用能力，使机体能量利用的效率提高。由于部分自由基是因组织缺氧而诱导产生，机体心肺系统能力的提高使这部分自由基减少。同时，长期中等强度游泳运动使机体处于氧化应激状态，长期训练能导致各种抗氧化酶活性显著提高，增强清除自由基的能力，从而减少代谢产物对膜结构的侵蚀和损害。

机体组织对内外环境变化等各种应激刺激，如冷应激、热应激和心理应激等均会对肾小球和肾小管的组织细胞产生影响。攻击行为的发生主要由遗传因素、环境因素和个体的生长影响而决定。当环境等各因素发生剧烈变化时，便会促发攻击行为，机体受应激影响继而使内稳态失衡，造成组织器官损伤。日常生活中存在许多应激源，家庭、学校以及社会等各个方面的不良刺激均能使机体生理机能发生改变，也会使机体自由基代谢异常，甚至氧化损伤。

本实验显示，攻击对照组大鼠肾皮质以及肾小管出现了水肿、淤血以及空泡样变性改变，证实攻击性应激会使肾脏发生形态学改变，提示攻击行为能造成机体组织器官的损害。其诱因可能与情绪激动、攻击行为等负情绪变化，使机体神经内分泌功能发生异常，肾脏循环与代谢改变，抗氧化能力下降，肾脏血流量异常，导致自由基产生增加，使膜的空隙增大，脆性增加，毛细血管内皮细胞损伤、发生炎症及退行性变，从而导致肾小管上皮细胞膜性结构中完整性丧失和损害。

3.2 游泳对攻击行为大鼠肾脏HSP70影响的生物学分析

HSP70家族是HSP家族中最重要的部分，在体内含量最高，受到应激时生成最为明显［10］，被认为是细胞受到应激时的指示器［11］。由于HSP70对应激有高度敏感性和在评价应激反应程度中的有效性，常被用来研究应激保护。研究显示，心理应激可以使大鼠咬肌自由基代谢出现异常，而长期心理应激使咬肌中HSP70表达增加能减轻自由基对咬肌的损伤［12］。预热适应诱导的HSP70的表达，对大鼠运动性骨骼肌损伤有明显保护作用［13］。中长跑运动员10d热适应过程中机体热调节反应增强，可能是热适应运动中出现HSP70水平升高等热适应性变化，使机体有效地建立了热适应的结果［14］。

HSP70的表达量可以反应应激程度，机体细胞内外环境的改变诱导应激蛋白HSP70的合成是保护性反应，在一定范围和阶段内，这种反应能够保证细胞的功能。但若超过机体对抗应激的范围，使HSP70长时间过高表达，提示该刺激对机体造成损伤。研究显示，过度训练和有氧训练相比，心肌细胞HSP70表达明显升高［15］。长时间的心理应激也可以引起机体 HSP70的过高表达［2］，因此认为HSP70的高表达预示着机体已造成损伤。本实验显示，攻击对照组肾脏损伤明显大于安静组，而肾脏HSP70的表达也显著高于安静对照组，说明攻击对照组大鼠肾脏已经发生了应激损伤。

研究认为，运动作为一种应激，会诱导机体HSP70的产生，而不同训练方式对机体HSP70蛋白表达产生的影响不同。一次力竭离心运动即刻大鼠腓肠肌HSP70显著增加，随着恢复时间的延长表达下降［16］。长期中等强度训练的个体HSP70的表达量低于普通个体［17－18］。

本实验显示，群居游泳组HSP70低于安静对照组，可能是由于游泳运动的负荷刺激增强了机体的内分泌－免疫调节功能，是机体适应机制良好的表现。游泳运动使机体产生良好的内分泌－免疫调节机制，可以提高机体内稳态功能，增强抵抗力和适应能力。而攻击行为是一种负情绪，使大鼠皮质酮水平升高，持续升高的皮质酮又会使机体代谢发生异常，内环境稳态遭到破坏，对组织脏器造成损伤。攻击组大鼠和攻击游泳组大鼠肾脏均出现不同程度的形态学改变，肾小球肥大并伴有淤血现象，肾小管上皮细胞出现水肿，部分管腔扩张，部分肾小管上皮细胞出现空泡样变性，管腔中有少量脱落的上皮细胞及绒毛，进而也影响了肾上腺功能，儿茶酚胺与皮质酮分泌功能发生异常。肾脏是机体重要的调节器官，代谢异常对肾脏功能具有一定的影响。本实验显示，8周中等强度的游泳运动使得攻击游泳组肾脏HSP70的表达低于攻击对照组，高于安静对照组。可能由于中等强度的游泳干预使肾小球及肾小管的结构和功能都得到了加强，神经内分泌功能及抗氧化能力均得到提升，使肾脏产生了良好的适应。双因素方差分析表明，游泳运动和攻击性应激的共同作用对大鼠肾脏HSP70的表达产生显著影响，游泳运动的干预可能降低了攻击性行为大鼠的应激损伤程度，提示中等强度的游泳运动拮抗了过强的应激反应，使肾脏损伤降低。相关机制还需要进一步实验探索。

4 结论

通过以上研究结果发现，攻击行为大鼠部分肾小球出现淤血现象，肾小管上皮细胞水肿，甚至出现空泡样变性，官腔中存在少量脱落细胞。通过中等强度游泳运动可以缓解攻击行为大鼠肾脏的形态学改变。

攻击行为大鼠肾脏HSP70含量显著增加，可能与肾脏应激损伤相关。通过中强度游泳运动使攻击行为大鼠肾脏HSP70表达下调，可能与拮抗应激反应，使肾脏损伤降低相关。

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