急诊重症监护病房耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分子流行特征

刘淑敏， 许云敏， 牛 敏， 陈瑞春， 杜 艳

·论著·

急诊重症监护病房耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分子流行特征

刘淑敏， 许云敏， 牛 敏， 陈瑞春， 杜 艳

目的 了解急诊重症监护病房(EICU)耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的分子流行特征，为临床抗感染及合理用药提供依据。方法 收集2011年12月—2014年10月入住EICU患者送检标本且经VITEK 2鉴定为CRE，进行改良Hodge试验、金属酶和超广谱β内酰胺酶(ESBL)表型确证试验，聚合酶链反应(PCR)检测CRE菌株携带的耐药基因，通过肠杆菌基因间重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术进行同源性分析，明确EICU是否存在克隆株的流行。结果 ①EICU分离的CRE菌株高产碳青霉烯酶和ESBL，改良Hodge试验、金属酶和ESBL表型确证试验阳性率分别为96%、13%和52%，其中以KPC-2、TEM和SHV为主，各自携带率分别为86%、86%和96%。②从2株耐碳青霉烯类的大肠埃希菌和1株阴沟肠杆菌中分离出较少见的B类碳青霉烯酶耐药基因NDM-1。③ERIC-PCR分析表明 EICU分离的CRE菌株中48株肺炎克雷伯菌的电泳图谱相同，3株大肠埃希菌和1株阴沟肠杆菌的电泳条带各不相同。结论 EICU中分离的CRE高产碳青霉烯酶和ESBL，且为同一克隆菌株播散，表明该院耐药形势严峻，积极的预防和抗感染势在必行。

重症监护病房； 碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌； 同源性

急诊重症监护病房 (emergency intensive care unit, EICU) 是医院感染的高发科室，由于人员流动性大、患者病因复杂、病情危重，高效广谱抗菌药物使用率高和多接受过有创治疗等，给临床抗感染带来一定困难。有资料表明在EICU发生的感染中以革兰阴性杆菌居多，其中以肠杆菌科细菌常见。针对此类感染临床以碳青霉烯类抗生素作为最后一道防线，但随着其使用率的增加，菌株发生相应变异导致了碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenem resistantEnterobacteriaceae，CRE)的产生，这不仅很大程度上限制了EICU患者的用药，使其危重病情不能及时有效缓解，同时也给临床治疗带来很大压力。本文旨在通过对EICU CRE的分子特征进行分析，为临床抗感染提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 收集我院2011年12月—2014年10月EICU送检的临床非重复标本，标本来源主要有尿液、痰、引流液、血液和胸腹水。

1.1.2 培养皿 哥伦比亚血琼脂平皿、麦康凯平皿和MH药敏平皿均购自郑州安图生物技术公司。

1.1.3 鉴定卡、药敏卡和药敏纸片 鉴定GN卡和药敏GN14卡购自法国生物梅里埃公司， 亚胺培南、美罗培南和厄他培南纸片均购自英国OXOID公司，EDTA纸片购自杭州天和微生物公司。用VITEK 2系统对 52株细菌进行初步鉴定、药敏试验，部分药敏试验采用K-B法进行，主要药敏纸片包括：头孢唑林、四环素、头孢曲松、左氧氟沙星、氨曲南、环丙沙星、氨苄西林、头孢吡肟、头孢他啶、阿米卡星、庆大霉素、磷霉素、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、头孢哌酮-舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、厄他培南。

1.1.4 试剂 聚合酶链反应(PCR)扩增所用的引物见表1，PCR所用试剂均购自TIANGEN(北京)科技有限公司。

表1 引物序列及相关文献

1.1.5 仪器 Bact/ALERT全自动血培养仪和VITEK 2全自动微生物鉴定与药敏分析仪购自法国生物梅里埃公司，CO2培养箱购自昆明友宁科技公司，1G603二级A2生物安全柜购自美国Baker公司， SW-CJ-1F超净工作台购自苏州净化设备公司，MyCyclerTM thermalCycler DNA扩增仪及用于电泳的power pac3000型电泳仪和50×TAE buffer由 美国Bio-Rad公司生产，凝胶成像系统(imageQuant LAT500)由美国GE公司生产。

1.1.6 质控菌株 大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853；药敏结果判断参照2013年美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准。

1.2 方法

(1)厘清尾矿资源属性，摸清尾矿资源家底。亟待对全国矿山尾矿资源进行调查评价，查清固体废弃物的堆存量、堆存位置、矿物组成和化学组成等综合利用特征；建立全国矿山尾矿数据库，为尾矿的综合利用提供数据支撑。

1.2.1 表型确证试验

1.2.1.1 碳青霉烯酶和超广谱β内酰胺酶(ESBL)表型确证试验 严格按照2013年CLSI推荐方法进行。对52株分离自EICU的CRE菌株分别进行耐药表型确证试验，包括改良Hodge试验、金属酶(MBL)和ESBL的表型确证试验；其中改良Hodge试验曾被推荐为碳青霉烯酶表型确证试验，EDTA协同试验用于MBL的确证，ESBL表型确证试验用于检测ESBL。

1.2.1.2 PCR扩增CRE菌株的耐药基因 煮沸裂解法提取细菌DNA，扩增的碳青霉烯酶基因包括blaKPC、blaSME、blaIMP、blaVIM、blaNDM-1、blaOXA-48，扩增的β内酰胺酶基因包括blaTEM、blaSHV、blaCTX-M。引物由Invitrogen公司合成，2%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果显示阳性的扩增产物送Invitrogen公司做测序分析。

1.2.1.3 EICU分离的CRE菌株同源性分析 采用重复序列PCR (Rep-PCR)的方法，对分离菌株基因组DNA分子进行分型，探讨菌株间的同源性。设计引物(ERIC2 5＇-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′)[7],反应体系为50 μL，包括2×TaqPCR Master MIX 25 μL, 25 mmol/L MgCl22 μL,ddH2O 20.5 μL, DNA模板2 μL，引物0.5 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性 1 min,40 ℃退火 1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环; 最终延伸72 ℃ 8 min。扩增产物 在 1.5 %琼脂糖凝胶中120 V电泳35 min ，电泳结束后在紫外凝胶成像仪下拍照。结果判断标准以扩增条带位置完全相同为同一基因型,主条带位置相同，副带相差 1～2条者为亚型，不符合上述条件者为不同基因型[8]。

2 结果

2.1 菌株分布及药敏结果

共收集52株来自EICU的CRE菌株，其中肺炎克雷伯菌48株、大肠埃希菌3株、阴沟肠杆菌1株。标本来源以呼吸道痰液居多，占61.5%，其次为尿液、血液、胸腹水和引流液。药敏结果显示对头孢菌素类及含酶抑制剂耐药率均为100%，对碳青霉烯类耐药率均>85%。见表2。

表2 52株CRE菌株对常用抗菌药物的药敏试验结果

2.2 耐药表型及基因分型结果

本研究中50株菌改良Hodge试验阳性(图1A)，6株MBL确证试验阳性(图1B)，45株KPC-2阳性(图2A)，且改良Hodge试验同时阳性，其中44株为肺炎克雷伯菌，1株为阴沟肠杆菌；MBL基因型阳性率很低，2株肺炎克雷伯菌IMP阳性，2株大肠埃希菌和1株阴沟肠杆菌经测序NDM-1阳性(图2B)；另外，ESBL相应基因型阳性率较高，以SHV和TEM为主，CTX-M仅13%为阳性，而ESBL表型阳性率稍低，可能是由于携带多种不同的基因型而掩盖其本身的耐药表型。

ERIC-PCR是利用细菌基因组中广泛分布的短小、高度保守且重复的序列为模板,经PCR扩增出多态性的DNA图谱，结果可靠,是目前常用的简便、快速的基因分型技术。本研究分离自EICU的52株CRE菌，经电泳图谱比对发现47株肺炎克雷伯菌为相同克隆菌株，1株肺炎克雷伯菌肺炎亚种与其他相差2条条带，可能为不同亚型，1株阴沟肠杆菌为不同的条带，3株大肠埃希菌各为不同的克隆菌株。

图1 (A)改良Hodge试验；(B)EDTA协同试验阳性

A. Lane M: DNA Marker; Lane 1: positive control; Lane 2: negative control; Lane 3: negative bacteria; Lanes 4-12: positive bacteria.

B. Lane M: DNA Marker; Lane 1: NDM-1 negative control; Lane 2: positive control; Lane 3: negative bacteria; Lanes 4-6: positive bacteria; Lanes 7-8: IMP positive bacteria; Lane 9: negative control; Lane 10: positive control; Lane 11: negative bacteria.

图2 (A)KPC-2(920 bp)电泳图；(B)NDM-1(475 bp)和IMP(587 bp)电泳图

Figure 2 Electrophoretogram of KPC-2 (920 bp) (A), as well as NDM-1 (475 bp) and IMP (587 bp) genes (B)

3 讨论

由于ICU收治的多为病情危重患者、大多存在侵袭性操作且科室环境复杂，所以医院感染发生率较普通病房高出3～18倍[9]。资料表明医院感染50%以上发生在ICU，其病原菌以革兰阴性杆菌为主[10]。碳青霉烯类抗生素曾是治疗革兰阴性杆菌感染最有效的药物，但随着此类抗生素在临床上广泛应用，碳青霉烯类耐药现象在肠杆菌科细菌中呈逐渐增高趋势，以肺炎克雷伯菌尤为明显。本研究CRE菌株中肺炎克雷伯菌占的比例最高(92%)，且为多重耐药菌株，甚至可能是泛耐药菌株，主要原因是高产ESBL和碳青霉烯酶。有文献报道，改良Hodge试验对KPC-2和OXA有较好的灵敏度[11-12]，但对VIM、IMP和NDM不敏感；ESBL的耐药表型确证试验的灵敏度和特异度均较低，这可能是由于EICU中病原菌耐药机制复杂、合并多种ESBL的产生。EDTA协同试验是一种临床上最为实用的MBL初筛方法[13]，然而该方法主要是针对B类MBL，对KPC、OXA-48等特异度较低[14-15]。

本研究碳青霉烯类耐药基因以KPC-2型为主，阳性率占86%，属于A类碳青霉烯酶，可水解碳青霉烯类抗生素；ESBL以TEM和SHV为主，阳性率分别为86%、96%，对β内酰胺类抗生素耐药，这与国外文献报道相符[16]。另外，由于本次研究对象主要为肠杆菌科细菌，而获得性MBL又主要存在于铜绿假单胞菌和不动杆菌属中[17]，所以MBL耐药基因阳性率较低。本实验中IMP阳性率为4%，VIM无阳性菌株，NDM-1阳性率为6%，包括2株大肠埃希菌和1株阴沟肠杆菌。Zhou等[18]报道在大肠埃希菌和阴沟肠杆菌中也分离出了NDM-1。而NDM-1是2008年首次分离于印度新德里的1株肺炎克雷伯菌中，曾被视为“超级细菌”，说明NDM-1在国内已经开始播散，应引起我们高度重视。耐药基因SME和OXA-48未扩增出阳性菌株，这可能是因为SME主要存在于由染色体介导的黏质沙雷菌中，OXA-48水解底物谱狭窄，水解效能较低。

本研究中47株肺炎克雷伯菌经同源性分析电泳条带相同，1株肺炎克雷伯菌肺炎亚种与其相差2条条带，为不同亚型，说明EICU存在克隆菌株流行趋势。本院主要流行的基因型有KPC-2、SHV、TEM,其中KPC-2可引起医院感染暴发，尤其是在ICU播散能力很强、致死率相当高[19]。Woodford等[20]研究发现，KPC型碳青霉烯酶在菌属之间克隆播散能力如此强大，主要因为KPC型碳青霉烯酶基因位于Tn4401的转座子上，虽然不同地区该结构不完全一样，但其转染细菌的能力没有太多差异。大肠埃希菌和阴沟肠杆菌的ERIC-PCR电泳条带各不相同，为散发性的。NDM-1型耐药基因的出现应引起我们的高度重视，有必要深入研究其耐药机制，并重视耐药监测。特别是呼吸道感染，可能由于患者长期卧床，痰液排出受阻，频繁侵袭性操作使患者呼吸道防御功能受损且未严格无菌操作，而导致交叉感染。同时多数患者在入住EICU前均用过多种抗菌药物，使患者体内免疫力低下且菌群失调。有研究表明，对重度感染患者起始合理的治疗会降低患者病死率[21]，所以我们应根据不同病情制定相应抗菌药物使用策略，如循环治疗、降阶梯治疗、短程治疗等。最后，应该提高大家对感染监控的认识和手卫生的执行率，加强对周围环境卫生的管理，从而阻断耐药菌的产生和传播，预防和控制感染的发生。

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Molecular epidemiology of carbapenem-resistantEnterobacteriaceaein an emergency intensive care unit

LIU Shumin, XU Yunmin, NIU Min, CHEN Ruichun, DU Yan

. (The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Yunnan Institution of Laboratory Diagnostics, Kunming 650032, China)

Objective To characterize the molecular epidemiology of carbapenem-resistantEnterobacteriaceae(CRE) in an emergency intensive care unit (EICU) for rational antimicrobial therapy. Methods Specimens were collected between December 2011 and October 2014 from patients treated in the EICU to isolate and identify CRE strains by an automated analyzer (VITEK 2). Modified Hodge test (MHT), metallo-beta-lactamases (MBL) and extended spectrum β-lactamases (ESBLs) phenotype confirmation test, and polymerase chain reaction were carried out to characterize the strains. The homology of strains was analyzed by enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR. Results A total of 52 strains of CRE were identified. Carbapememase and ESBLs were highly prevalent in the CRE isolated from this EICU. Overall, 96%, 13% and 52% of the strains were positive for MHT, MBL and ESBLs confirmation test, respectively. PCR analysis showed that majority of the enzymes were KPC-2, TEM, and SHV, a prevalence of 86%, 86% and 96%, respectively. NDM-1 gene was identified from two strains ofE.coliand one strain ofE.cloacae. ERIC-PCR demonstrated that 48 of the carbapenem-resistantK.pneumoniaeisolates belonged to the same genotype. Conclusions Carbapememase and ESBLs are highly prevalent in the CRE isolated from this EICU. Most of the CRE strains are from the same clone, suggesting the possibility of an epidemic. It is necessary to put aggressive infection control measures in place to control the spread of these bacteria.

emergency intensive care unit; carbapenem-resistantEnterobacteriaceae; homology

云南省联合专项基金项目(2012FB040)。

昆明医科大学第一附属医院检验科，云南省实验诊断研究所，昆明 650032。

刘淑敏(1988—)，女，硕士研究生，主要从事细菌耐药研究。

杜艳，E-mail：duyan_m@139.com。

R978.11

A

1009-7708(2015)04-0372-05

2014-12-17

2015-01-27