螺旋环螺旋结构域扩散激酶(CHUK)基因多态性影响缺血性中风痰瘀阻证血脂代谢*

韦湫桂，吴艳丽，陈子文，周金英，谢娟娟，古 联△

(1.广西中医药大学研究生学院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

·实验研究·

螺旋环螺旋结构域扩散激酶(CHUK)基因多态性影响缺血性中风痰瘀阻证血脂代谢*

韦湫桂1，吴艳丽1，陈子文1，周金英1，谢娟娟2，古 联2△

(1.广西中医药大学研究生学院，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

目的 分析CHUK 基因多态性与缺血性中风风痰瘀阻证及气虚血瘀证血脂水平的关联。方法 共纳入341例风痰瘀阻证及284例气虚血瘀证缺血性中风病例。采用Sequenom MassARRAY iPLEX进行CHUK 3个位点(rs3808917，rs2230804，rs3808916)基因分型，运用HITACHI日立7600 全自动生化分析仪测定血脂水平。结果 在风痰瘀阻证患者中，TG(TG：F=3.125，P=0.045)、LDL-C(LDL-C：F=3.58，P=0.029)水平在不同rs3808917基因型携带者之间的分布差异均具有统计学意义。在气虚血瘀证患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同CHUK基因多态性基因型携带者之间、或在不同等位基因携带者之间的分布差异均无统计学意义(P>0.050)。结论 CHUK 基因遗传多态性可能影响缺血性中风痰瘀阻证的血脂代谢，但不影响气虚血瘀证的血脂水平。

中风证型；CHUK基因；遗传多态性；血脂

中医学认为缺血性脑卒中属于“中风”，全球每年约550 万人死于中风，且每年用于治疗中风的费用高达38.6 亿美元[1]。动脉粥样硬化是中风发生的主要病机之一，而血脂紊乱与动脉粥样硬化形成有密切关系。螺旋环螺旋结构域扩散激酶(CHUK)基因编码的蛋白质是核因子NF-kappa-B复合物的抑制剂，其参与调控的NF-kappa-B通路可影响中风的病理过程[2]。既往有研究表明CHUK基因rs11597086位点与血脂升高有关[3]，提示CHUK基因多态性可能影响血脂代谢。中医学认为中医证型具有一定分子遗传基础[4]，基因序列的多态性决定了个体的差异，在临床则表现为不同的证候群[5]，并可能影响不同证候群相关生化基础物质。本研究旨在分析CHUK基因3个分别位于5’near端，外显子，3’near端的多态性位点(rs3808917，rs2230804，rs3808916)与缺血性中风风痰瘀阻证、气虚血瘀证血脂水平的相关性。

1 对象和方法

1.1 研究对象 纳入625例于2009年7月—2014年6月在广西中医药大学第一附属医院中医脑病科住院的缺血性中风病例，包括341例风痰瘀阻证，平均年龄(64.46±10.42)岁、284例气虚血瘀证，平均年龄(66.99±10.45)岁。西医诊断标准：参照全国第四届脑血管病学术会议修订的《各类脑血管病诊断要点》中相关标准。所有患者均经过至少两名主治以上职称的神经内科医师及影像学检查(头颅CT和、或MRI)确诊。中医诊断标准及证候辨证分型标准：参照国家中医药管理局全国脑病急症科研协作组制订的《中风病诊断疗效评定标准(试行)》，每名缺血性中风患者均经2名经统一培训的主治以上职称的中医医师进行中医证候分型。本研究纳入符合中西医诊断及证候辨证分型标准的2个证型(风痰瘀阻、气虚血瘀证)的中风患者进行研究。排除标准：(1)有肿瘤、心脏源性栓塞、脑外伤、短暂性脑缺血发作(TIA)、脑血管畸形等其他原因引起的缺血性中风；(2)合并系统性疾病。所有研究对象均为自我报告为广西汉族人，相互之间均无亲缘关系，且均知情同意。

2 标本DNA提取 于研究对象入院后次日清晨空腹时抽取2ml静脉血于抗凝管内，混匀，4℃冰箱保存，并在7d内完成DNA提取。采用北京天根科技有限公司生产的TIANamp Blood DNA Kit(离心柱形)血液基因组DNA提取试剂盒严格按照产品说明书操作步骤进行血液基因组DNA提取，提取完成后分装为3管，放置于-80℃保存备用。

3 基因分型 采用Sequenom MassARRAY iPLEX实验平台对CHUK基因3个位点进行基因分型。采用Sequenom Assay Designer 3.1software(Sequenom，San Diego，CA，USA)进行引物设计，引物序列如表1所述。PCR反应体系(总体积为5μl)构建如下：10 ng/μl DNA 模板1 μL，10 x PCR Buffer0.5 μL，25 mM MgCl20.4 μL，25 mM dNTP Mix0.1 μL，0.5 uM Primer Mix1μL，5 U/μL HotStar Taq0.2 μL，和H2O 1.8 μL。

表1 候选SNPs 的引物序列信息

1.4 血脂水平测定 抽取研究对象外周静脉血2 mL，置于非抗凝管内，并直接送往医院检验科采用HITACHI日立7600 全自动生化分析仪按照标准化试验程序检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平。

2 结果

2.1 不同rs3808917基因型、或等位基因携带者之间的血脂水平比较 在风痰瘀阻证患者中，Tg，LDL-C水平在不同rs3808917基因型携带者之间的分布差异具有统计学意义(TG：F=3.125，P=0.045；LDL-C：F=3.58，P=0.029)。在气虚血瘀证患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在rs3808917位点不同基因型携带者之间的分布差异均无统计学意义(P>0.050)，且A等位基因和C等位基因携带者之间的TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平差异亦无统计学意义(P>0.050)。见表2、表3。

表2 风痰瘀阻证患者中不同rs3808917 基因型、或等位基因携带者的血脂水平比较

表3 气虚血瘀证患者中不同rs3808917 基因型、或等位基因携带者的血脂水平比较

2.2 不同rs2230804基因型、或等位基因携带者之间的血脂水平比较 在风痰瘀阻证患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs2230804基因型携带者之间的分布差异均无统计学意义(P>0.050)，它们在不同等位基因携带者之间的分布差异亦无统计学意义(P>0.050)。在气虚血瘀证患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs2230804基因型携带者之间的分布差异均无统计学意义(P>0.050)，它们在不同等位基因携带者之间的分布差异亦无统计学意义(P>0.050)。见表4、表5。

表4 风痰瘀阻证患者中不同rs2230804 基因型、或等位基因携带者的血脂水平比较

表5 气虚血瘀证患者中不同rs2230804 基因型、或等位基因携带者的血脂水平比较

2.3 不同rs3808916基因型、或等位基因携带者之间的血脂水平比较 在风痰瘀阻证患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平水平在不同rs3808916基因型携带者之间的分布差异均无统计学意义(P>0.050)，它们在不同rs3808916等位基因携带者之间的分布差异亦无统计学意义(P>0.050)。在气虚血瘀证患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs3808916基因型携带者之间的分布差异均无统计学意义(P>0.050)，且T等位基因和C等位基因携带者之间的TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平差异亦无统计学意义(P>0.050)。见表6、表7。

表6 风痰瘀阻证患者中不同rs3808916基因型、或等位基因携带者的血脂水平比较

表7 气虚血瘀证患者中不同rs3808916基因型、或等位基因携带者的血脂水平比较

3 讨论

中医学认为中风病主要病机为本虚标实，其病理因素主要有虚、火、风、痰、气、血、毒六邪。朱丹溪首提“半身不遂，大率多痰。多是湿土生痰，痰生热，热生风也”；《明医杂著》曰：中风乃血气津液所行之处，皆凝滞郁遏，不得流通所致。“痰”停聚于体内，造成一系列错综复杂的病理过程；膏脂与津液同源，是津液的稠浊状态即为膏脂，其能入血。目前“痰瘀故邪、痰致中风”已深入人心。现代医学认为血管壁病变、血液成分和血液动力学改变是引起中风的主要原因。动脉粥样硬化是其基本病因之一，而高脂血症被认为是通过引起动脉粥样硬化而引起脑血管病。《赤水玄珠全集》曰：若血浊气滞，则凝聚为痰，滞于营中，浸淫血脉，即成血脉痰浊。而血浊、痰凝与现代医学高血脂症的概念相似，是中风发病的重要病理基础之一。

CHUK基因编码核因子NF-kappa-B复合物的一种抑制剂，其编码的蛋白可使NF-kappa-B信号通路上的节点磷酸化，从而激活核录因子NF-kappa-B，促进成套促炎基因的表达，最终促进了动脉粥样硬化形成[6]。在Asselbergs的meta研究中发现CHUK基因上rs11597086位点与血脂紊乱有关[3]。而笔者的研究发现在风痰瘀阻证患者中，Tg，LDL-C水平在CHUK多态性rs3808917不同基因型携带者之间的分布差异具有统计学意义，提示CHUK基因rs3808917多态性影响中风风痰瘀阻证的血脂代谢。rs3808917 位于临近5’UTR端，而5’非编码区(5’UTR)已被证明在翻译表达过程中通过与某些调控因子的结合对基因差异表达进行调控[7]。中医医家认为痰饮内停阻滞气机易形成瘀血，而瘀血内阻亦影响津液代谢，进一步形成痰饮。朱丹溪则提出“治风当以治痰”。名医关幼波提出痰与血同属阴，易于交结凝固，治痰要治血，血行则痰化，可见痰瘀是缺血性中风最主要的病机。现代医学已经证明脂质代谢紊乱是引起颈动脉的粥样硬化的物质基础，而颈动脉粥样硬化与中风的发生密切相关[8-10]。赵玲等[11]认为高脂血症为血中有痰浊之气，痰浊瘀血凝聚滞于血中致血液呈“黏”、“浓”、“凝”、“聚”状态，表明脂质代谢异常的病理改变属于“痰瘀”范畴。黄先长等[12]在血脂与中风中医证型研究中，发现血清TC、TG及LDL-C水平等血脂指标可作为中风证型的生化物质基础。与我们研究结果相类似的是，既往已有中医学研究报道易感基因遗传多态性影响中医证型的血脂代谢。如欧阳涛[13]发现在冠心病痰瘀证中，TG和LDL-C 水平在-/-、-/+、+/+基因型患者中存在渐升的趋势，+/+基因型的TC 水平和动脉硬化指数显著高于-/-基因型，表明LDL-R基因可能影响冠心病痰瘀证的血脂代谢，从而促进动脉硬化形成。另外梁晋普等[14]人报道ApoE基因多态性可能影响高脂血症痰瘀证的血脂代谢，且占呈燕等[15]更进一步的研究发现在痰瘀证高脂患者中，TG水平在ApoE基因携带E2/3基因型与携带E3/3和E3/4基因型的分布差异显著。而现代医学研究也发现一些遗传多态性位点基因型的差异会导致缺血性中风的血脂代谢差异。例如，Peng[16]等人研究发现TG水平在TGF-β1基因C-509T位点携带TT基因型、TC基因型及CC基因型分布具有显著性差异，还发现LDL-C水平在该基因869T/C位点上携带TT基因型、TC基因型及CC基因型分布同样具有显著性差异；另有陈玉兰[17]等报道Ser447Ter基因G等位基因的血脂(TC、TG及HDL-C)水平较C等位基因携带者高，提示Ser447Ter基因影响缺血性中风的血脂水平。

因此，根据本研究结果，CHUK基因多态性可能影响缺血性中风风痰瘀阻证的血脂代谢。

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Influence of Helix-loop-helix Domain Diffusion Kinase (CHUK) Gene Polymorphism on Lipid Metabolism of Ischemic Stroke and Phlegm Stasis Resistance Syndrome

WEI Qiu-gui1, WU Yan-li1, CHEN Zi-wen1, ZHOU Jin-ying1, XIE Juan-juan2, GU Lian3

(1.SchoolofPostgraduates,GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530001,Guangxi;2.ICUDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530023,Guangxi;3.NeurologyDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530023,Guangxi)

Objective: To analyze the correlation of CHUK gene polymorphism and ischemic stroke and phlegm stasis syndrome (PS) as well as lipid level of qi deficiency blood stagnation syndrome(QDBS). Methods: 341 PS patients and 284 ischemic stroke QDBS patients were taken into analysis. Sequenom Mass ARRAY iPLEX was used to conduct 3 loci of CHUK (rs3808917, rs2230804, rs3808916) genotyping. HITACHI 7600 automatic biochemical analyzer was used to detect blood lipid level. Results: Among the PSR patients, the distribution differences of TG (TG: F=3.125, P=0.045), LDL-C (LDL-C: F=3.58, P=0.029) between the different levels of rs3808917 genotype were statistically significant. Among the QDBS patients, the distribution differences of TC, Tg, HDL-C, LDL-C levels between different CHUK polymorphism genotype carriers, or between different allele carrier showed no statistical significance (P>0.050). Conclusion: The CHUK genetic polymorphism may affect the lipid metabolism of ischemic stroke PS patients, but does not affect the lipid level of the QDBS patients.

stroke syndrome, CHUK gene, genetic polymorphism, lipid

国家自然科学基金课题(NO.81260594)，广西自然科学基金课题(NO.2013 gXNSFAA019145)，广西中医药大学校级课题(NO.GZYQJ2014018)

韦湫桂(1986-)，女，广西人，研究方向：中西医结合防治脑血管疾病。

△通信作者：古联，E-mail：gulian2012@163.com

R255.2

A

1007-2349(2015)12-0061-04

2015-10-26)