响应面法优化茶籽黄酮提取工艺条件

刘华鼐，李琼，叶勇

（华南理工大学化学与化工学院，广东广州510641）

茶叶籽是山茶属植物茶（L）即茶树的果实，是茶叶生产的副产物。我国茶叶籽资源十分丰富，年产量约为80余万吨，大部分用于榨取茶油，剩余的副产品中含有很多有效成分，如茶皂素、茶多糖、黄酮等，可研究利用价值很高。目前在国内对茶皂素、茶多糖的研究多见，而茶籽中黄酮的提取研究鲜见报道。黄酮类化合物可以防止心血管、脑血管和呼吸系统疾病，还有消炎，抑菌，抗糖尿病，抗辐射，抗癌，抗肿瘤和增强免疫等药理作用，同时也是重要的功能食品添加剂、天然抗氧化剂、天然色素等。黄酮类化合物的提取方法主要有水和溶剂浸提法[1-2]、超声波法和微波辅助提取法[3-4]、以及酶解法[5]等。

响应面分析法（RSM）是由Box—Wilson开发的一种综合的数学建模、数据分析方法，主要用于化学过程中多个因素的因子优化。通过响应面法，可以对单个变量因子对目标变量的影响进行分析，也可以对多个试验变量的最优搭配进行精确的数学估计，确定最优的因子条件。响应面法对工艺条件的优化具有更加可靠的数学依据支持，对最优条件的探索能精确到最具体的值，可以弥补正交试验设计等方法的缺陷[6]。

本试验以茶籽为原料，采用乙醇作为溶剂提取黄酮，研究了液料比、提取温度、提取时间对黄酮提取率的影响；通过响应面法优化提取工艺条件。不但提高了茶籽中黄酮的提取率，而且极大地缩短了提取周期，该研究将利于茶籽的综合利用。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

油茶籽：湖南茶农业有限公司；芦丁标准品：美国sigma公司。

石油醚60～90、硝酸铝、氢氧化钠、亚硒酸钠、乙醇，均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

DZF-6050真空干燥箱：上海博迅实业有限公司；UV-2800紫外可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；WD-9419粉碎器：北京华运安特；JY10001分析电子天平：上海高致密仪器；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 茶籽黄酮提取与分离工艺流程

茶叶籽去壳、干燥、粉碎，过60目筛得干粉。再取适量经过前处理的茶籽干粉，置于索氏提取器中用石油醚进行除油；然后取去油粉末3.000 g置于锥形瓶中用乙醇进行回流提取，一定时间后趁热抽滤即得黄酮提取液。

1.4 方法

1.4.1 黄酮测定方法

以芦丁标准样为基准，采用硝酸铝络合-紫外分光光度法测定茶籽黄酮含量。所得芦丁浓度（X）与吸光度（Y）的标准曲线适用范围为（0～100 μg/mL）：Y=11.271X-0.010 7，R2=0.998 4。

1.4.2 单因素试验

影响黄酮得率的因素比较多，本实验主要从液料比、提取温度、提取时间及乙醇的浓度等几个方面进行单因素试验。初步确定较佳的提取工艺条件。

1.4.3 响应面法优化茶籽黄酮提取条件研究

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选定乙醇浓度、液料比、提取温度为考察因子，采用响应面法，在三因素三水平上对茶籽黄酮提取工艺进行优化试验，响应面因素水平编码表如表1所示。

表1 水平编码表Table 1 Level code of each factor

1.4.4 数据分析

采用Desing-Expert8.0.5软件对响应面的试验数据进行二次多项回归拟合、方差分析、显著性检测和响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果及其分析

乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度对黄酮得率的影响见图1所示。

图1 乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度对黄酮得率的影响Fig.1 Effects of the ethanol concentration，the ratio of solid and solution，the time，and the temperature on the yield of total flavonoids

由图1可知，由茶籽中提取黄酮较佳的工艺条件为：在80℃的温度下，液料比为 25∶1（mL/g），乙醇浓度60%，提取2 h。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面法试验结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理[7-9]，选定提取温度，乙醇浓度和液料比作为考察因素（因为2 h后提取时间对总黄酮提取率影响不大，故设定2 h为最佳条件，不再进行考察）。在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应曲面分析法进行分析。试验结果如表2所示。通过Design Expert软件对表2的试验数据进行多元回归拟合及对模型进行方差分析，得到以下回归方程：Y=-59.064 68+0.524 36X1+1.001 08X2+1.476 37X3+0.001 752 52X1X2+0.003 396 7X1X3-0.006 230 85X2X3-0.004 616 08X12-0.007 971 38X22-0.023 330X32，式中：Y 为黄酮的提取率，mg/g；X1为提取温度，℃；X2为乙醇浓度，%；X3为液料比，mL/g。

该方程中各项系数绝对值的大小直接反映各因素对响应值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。由于该方程的二次项系数均为负值，可以推断方程代表的抛物面开口向下，因而具有极大值点，可以进行优化分析。由方程的一次项系数可以得出，影响茶籽黄酮提取率的主次顺序为：液料比＞乙醇浓度＞提取温度。

2.2.2 回归方程的方差分析及系数显著性分析

回归模型方差分析见表2。

表2 响应面优化回归方程的方差分析Fig.2 Variance analysis of regression equation

由表2可知，F值=27.7，P值为0.000 1，说明该模型是有效可靠的，达到极显著水平（P＜0.001），有意义。失拟项是模型与实验拟合程度的标准，本次模拟中失拟项的P值为0.052 9＞0.05，不显著，对模型有利。R2=0.972 7，说明该模型能解释97.27%响应值的变化，R2Adj=0.937 6，说明可信度较好，因此可以运用该拟合模型对对茶叶籽中总黄酮的提取率进行分析预测。

2.3 茶籽黄酮提取率的响应面分析图

响应面分析图是响应值对各试验因子A、B、C所构成的响应面图形。从响应面分析图可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。当特征值均为正值时，响应图为山谷形曲面，有极小值；当特征值为负值时，为山丘形曲面，有极大值存在；当特征值有正有负时，为马鞍形曲面，无极值存在。本试验根据回归方程进行不同因子的响应面分析，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，马鞍形或者椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。

图2为各因素对黄酮提取率影响的响应面图A。

对比3个响应面的形状及参数，以及等高线分析，可以看出，响应面顺着液料比的方向的陡度最大，结合方差分析，可以得出液料比在交互作用中对茶籽黄酮提取率的影响最显著，乙醇浓度的影响次之，提取温度的影响作用不够显著。对茶籽黄酮的提取率的影响的显著性大小如下：液料比＞乙醇浓度＞提取温度。

图2 各因素及其交互作用对黄酮提取率影响的响应面曲面图Fig.2 The effect of various factors and interaction on the yield of total flavonoids

利用RMS预测，通过对各个响应面的最高点的极值分析，通过对最高点取值，并对多元二次回归方程进行求解，得出各个因子的解，这个值即是最优工艺条件为：提取液料比为28.52∶1（mL/g），乙醇体积分数浓度59.76%，提取温度为77.91℃，在此条件下总黄酮提取2 h的理论值为13.342 4 mg/g。

2.4 工艺验证试验

采用Design-Expert软件分析回归模型，在各因素编码水平范围内，得出茶籽黄酮的最优工艺参数：液料比28∶1（mL/g）、乙醇体积分数 60%、提取温度 78℃，提取时间2h。为验证Box-Behnken试验设计所得结果的可靠性，采用上述优化提取工艺条件进行验证试验，5次平行试验所得茶籽黄酮平均得率为12.158 mg/g。与理论预测值误差为8.8%，表明该优化参数可靠，具有实用价值。

3 结论

应用响应面法优化得到水提取茶籽黄酮的最优工艺条件是液料比28∶1（mL/g）、乙醇浓度60%、提取温度78℃，提取时间2 h，测得的总黄酮平均含量为12.158 mg/g。得出结论液料比对总黄酮的提取率影响最大。因此，该研究结果对茶籽黄酮在茶籽综合利用领域的深入开发提供了一定理论依据和参考。

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