黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用

谢荣华，舒衡平

黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用

谢荣华1，舒衡平2

目的 探讨黄芪对弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫保护作用。方法 将小鼠随机分成pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组、pcDNA3 +黄芪治疗组、黄芪治疗组、pcDNA3及生理盐水对照组。将弓形虫pcDNA3-W2b2a肌注免疫pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠3次,末次免疫后4周，每组小鼠腹腔注射102个速殖子，感染后2 d起，pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组、pcDNA3 +黄芪治疗组及黄芪治疗组小鼠给予黄芪75 mg/d灌胃治疗，连续用药7 d，用ELISA法测定免疫前、末次免疫后4周、感染后6 d小鼠血清IgG水平及免疫前、末次免疫后2周、感染后4、6、8 d小鼠IFN-γ、IL-18水平，并观察弓形虫感染后小鼠的生存时间。结果 pcDNA3-W2b2a免疫小鼠后血清IgG抗体水平均高于其它组(P<0.05)，末次免疫后4周,感染后第6 d pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠特异性IgG抗体水平无显著性差异(P>0.05)；末次免疫后2周、感染后4 d、6 d、8 d pcDNA3-W2b2a+黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平分别高于其它组(P<0.05)；感染后各组小鼠血清IL-18水平持续上升,但感染后8 d，黄芪治疗后小鼠血清IL-18水平显著低于pcDNA3和生理盐水对照组(P<0.05)；小鼠RH株速殖子感染后，pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3 +黄芪治疗组及黄芪治疗组 (P<0.05)。结论 黄芪可增强弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫调节作用。

弓形虫；表位疫苗；黄芪；免疫调节

弓形虫是一种机会性致病原虫,引起人兽共患弓形虫病, 免疫功能正常者感染弓形虫绝大多数无症状，或者症状很轻,免疫功能抑制或缺陷者(如器官移植、恶性肿瘤及艾滋病人) 感染是导致其死亡的原因之一。目前常采用乙胺嘧啶和磺胺嘧啶联合治疗弓形虫病,但其毒副作用发生率高,且不能根治[1]。表位疫苗是利用基因重组技术将一个或者多个抗原表位的编码基因连接在一起，在宿主细胞内利用真核启动子来持续高效表达多个多肽类免疫原，以提高疫苗的免疫效果，其安全性好，诱发的免疫应答针对性强。本研究组在前期已构建了弓形虫新基因wx2b2a 表位疫苗质粒,能够诱导小鼠产生一定的抗弓形虫感染保护性免疫[2]，但效果也不甚理想。人体感染弓形虫后体内免疫应答失衡,而中药黄芪具有双向免疫应答的调节作用[3]，本研究探讨黄芪能否增强弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫保护作用。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 弓形虫RH株为本室传代保种、pcDNA3、pcDNA3-W2b2a为本室构建。

1.2 实验动物 6周龄昆明小鼠，雌雄各半，18～20 g，购自南华大学实验动物中心。

1.3 主要试剂与药物 黄芪颗粒，四川百利药业有限责任公司，国药准字Z20003380；HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京博大泰克公司；小鼠IFN-γ ELISA试剂盒，深圳晶美生物有限公司；小鼠IL-18 ELISA检测试剂盒, 日本MBL公司。

1.4 动物分组及实验方案 昆明小鼠90只随机分成6组，雌雄各半，分别为Ⅰ组：pcDNA3-W2b2a质粒组、Ⅱ组:pcDNA3-W2b2a质粒 +黄芪治疗组、Ⅲ组: pcDNA3 +黄芪治疗组、Ⅳ组：黄芪治疗组、V组：pcDNA3、VI组：生理盐水组。将pcDNA3-W2b2a质粒100 μL分别免疫Ⅰ组和Ⅱ组小鼠，从鼠左后腿胫后肌下端，以平行于肌肉纵轴的方向进针，共免疫3次，每次间隔2周；Ⅲ组、V组小鼠注射pcDNA3，Ⅳ组、VI组小鼠注射100 μL生理盐水。末次免疫后4周，每鼠腹腔注射0.2 mL含102的弓形虫RH株速殖子悬液。小鼠感染后2 d起, Ⅱ组、Ⅲ组及Ⅳ组小鼠给予黄芪灌胃治疗, 给药剂量每只鼠75 mg/d, 灌药量0.4 mL/鼠, 其它组给予相同量的蒸馏水灌胃。灌胃前2 h禁水禁食。连续给药7 d。

1.5 ELISA 法测定小鼠血清IgG 分别于免疫前、末次免疫后4周及感染后6 d小鼠断尾法取血,分离收集小鼠血清。将每次所取血清样品做1∶100稀释，用间接ELISA法检测免疫小鼠IgG抗体。

1.6 IFN-γ及IL-18 测定 免疫前、末次免疫后第2周及感染后4、6、8 d小鼠断尾法取血，分离收集小鼠血清，ELISA 方法测定小鼠血清IFN-γ及IL-18浓度。按试剂盒说明书操作。

2 结 果

2.1 小鼠血清特异性IgG抗体水平 pcDNA3-W2b2a免疫小鼠后血清IgG抗体水平均高于其它组(P<0.05)；末次免疫后4周,感染后6 d pcDNA3-W2b2a、pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠特异性IgG抗体水平差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。

2.2 小鼠血清IFN-γ水平 末次免疫后2周、感染后4 d、6 d、8 d pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平分别高于其它组(P<0.05)，而pcDNA3-W2b2a组、pcDNA3 +黄芪治疗组、黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平分别高于pcDNA3组和生理盐水对照组；感染后8 d各组小鼠血清IFN-γ水平较感染后6 d有所下降(P<0.05)(图2)。

图1 ELISA检测小鼠血清特异性IgG抗体结果

图2 ELISA检测小鼠血清IFN-γ结果

2.3 小鼠血清IL-18水平 末次免疫后2周、感染后4 d、6 d、8 d各组小鼠血清IL-18水平呈上升趋势；感染后8 d，黄芪治疗后小鼠血清IL-18低于pcDNA3和生理盐水对照组(P<0.05)(图3)。

图3 ELISA检测小鼠血清IL-18结果

2.4 小鼠感染后的存活时间 末次免疫后4周，每鼠腹腔注射0.2 mL含102的弓形虫RH株速殖子，实验小鼠均死亡。pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠存活时间长于其它组(P<0.05 )，pcDNA3-W2b2a、pcDNA3 +黄芪治疗组及黄芪治疗组小鼠存活时间长于pcDNA3 和生理盐组(P<0.05 )(表1)。

表1 速殖子攻击后各组小鼠存活时间±s)

注：﹡与pcDNA3-W2b2a、pcDNA3+黄芪治疗组、黄芪治疗组比较，P<0.05；#与pcDNA3和生理盐水组比较，P<0.05。

Note: ﹡As compared with the pcDNA3-W2b2a group, pcDNA3 +Astragalustreatment group ,Astragalustreatment group,P<0.05；# As compared with the pcDNA3 group, physiological sale group,P<0.05.

3 讨 论

为增强弓形虫疫苗的免疫效果，用其制成多表位疫苗，能诱导机体产生较高水平的保护性免疫应答。魏庆宽[4]构建pcDNA3-ROP2-p30-HSP70多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫，实验组小鼠存活时间明显延长。范久波[5]等研究弓形虫新基因wx、wx2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫。但单用弓形虫疫苗免疫效果还不是十分理想，目前有学者研究中药黄芪具有免疫调节作用及保护作用。黄芪可促进中性粒细胞及巨噬细胞的吞噬功能和杀菌能力，提高免疫抑制小鼠的IL-2、TNF-a、IFN-γ的水平，并可促进T淋巴细胞增殖[6]。邱宇安[7]等研究黄芪含药血清对血管紧张素Ⅱ致内皮细胞凋亡具有保护作用。黄芪注射液能提高重症急性胰腺炎大鼠外周血GSH-PX、SOD 活性，降低ROS活性和MDA浓度[8]，对重症急性胰腺炎有保护性作用。俞天虹[9]等研究大剂量黄芪组方的补阳还五汤能显著促进脑缺血后室下区神经干细胞增殖和神经功能恢复。黄芪在寄生虫病防治方面也具有一定的发展潜力，但其在直接抗寄生虫病效果方面还有待进一步研究，黄佩珺[10]等研究结果表明黄芪对低剂量速殖子感染的小鼠有保护作用，而对高剂量速殖子感染小鼠的保护作用不明显。有研究发现，通过黄芪提取物(Astragalusmembranaceus extracts，AmE)治疗弓形虫感染小鼠，或接种疫苗的小鼠能够显著延长存活时间，降低寄生虫的数量，并增强Th1型细胞免疫反应[11]。本研究结果显示，pcDNA3-W2b2a可诱导小鼠产生高水平的IgG特异性抗体，但黄芪对此作用不明显；pcDNA3-W2b2a可刺激小鼠产生高水平IFN-γ，感染后4、6 、8 d黄芪治疗后小鼠血清IFN-γ水平分别高于非治疗组，且pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠血清IFN-γ水平最高，提示黄芪可以促进pcDNA3-W2b2a刺激机体产生IFN-γ,增加宿主对速殖子的抗虫能力，但感染后8 d小鼠血清IFN-γ水平较感染后6 d有所下降，提示小鼠可能处于代偿性抗炎反应(CARS)引起的免疫抑制阶段,黄芪则通过诱生IFN-γ 改善宿主的免疫抑制状态。张晓莉[12]等研究黄芪水煎剂及黄芪多糖可提高隐孢子虫感染小鼠CD4、CD4/CD8 及IL-2、IL-4 和IFN-γ水平增强免疫功能促进隐孢子虫感染小鼠恢复。末次免疫后2周、感染后4、6、8 d各组小鼠血清IL-18水平呈持续上升；感染后8 d，pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠血清IL-18显著低于pcDNA3和生理盐水对照组，提示黄芪可能抑制IL-18的表达。本实验提示黄芪对弓形虫感染具有双向调节作用，一方面,诱导IFN-γ早期生成，上调抗虫免疫应答；另一方面抑制IL-18生成，下调免疫应答[13]。Mordue[14]等发现唯一可决定急性弓形虫感染小鼠生存的因子是IL-18，中和IL-18的作用可延长小鼠2 d的生存时间。小鼠感染试验表明，pcDNA3-W2b2a +黄芪治疗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3-W2b2a组和黄芪治疗组。由此可见，黄芪可增强弓形虫wx2b2a表位疫苗免疫小鼠后抗急性弓形虫感染的免疫保护作用。

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Shu Heng-ping, Email: hengpingshu@xysm.net

Immunomodulatory effect ofAstragaluson immune mice from the epitope vaccineswx2b2a ofToxoplasmagondiiagainst acuteT.gondiiinfection

XIE Rong-hua1,SHU Heng-ping2

(1.HunanPolytechnicofEnvironmentandBiology,Hengyang421001,China; 2.XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China)

We studied the immunomodulatory effect ofAstragaluson immune mice from the epitope vaccineswx2b2a ofToxoplasmagondii(T.gondii) against acuteT.gondiiinfection. The mice were randomly divided into Group pcDNA3-W2b2a, Group pcDNA3-W2b2a +Astragalustreatment, Group pcDNA3 +Astragalustreatment, GroupAstragalustreatment, and Group pcDNA3 and physiological saline. The mice in Group pcDNA3-W2b2a and Group pcDNA3-W2b2a +Astragalustreatment were intramuscularly immunized with pcDNA3-W2b2a ofT.gondiifor three times. Four weeks after the last immunization, the mice in each group were intraperitoneally injected with 102tachyzoites. Starting from 2 days after infection, the mice in Group pcDNA3-W2b2a +Astragalustreatment, Group pcDNA3 +Astragalustreatment, GroupAstragalustreatment were orally treated withAstragaluswith 75 mg/d for 7 days. ELISA method was taken to assay the serum levels of IgG before immunization, 4 weeks after the last immunization and 6 day post-infection (dpi) , and the levels of IFN-γ and IL-18 before immunization, 2 weeks after the last immunization and 4, 6 and 8 dpi, as well as to observe the survival time of the mice attacked byT.gondii. The serum levels of IgG of the mice which were immune with pcDNA3-W2b2a were higher than those in other groups (P<0.05). The levels of IgG antibodies in Group pcDNA3-W2b2a, Group pcDNA3-W2b2a +Astragalustreatment were almost the same in four weeks after the last immunization and 6 dpi (P>0.05). The levels of IFN-γ in Group pcDNA3-W2b2a +Astragalustreatment were higher than those in other groups (P<0.05) in 2 weeks after the last immunization and 4, 6, 8 dpi. The serum levels of IL-18 kept elevating after infection. But they are significantly lower than those in Group pcDNA3 and physiological saline after 8 days withAstragalustreatment (P<0.05). After infection with RH tachyzoites, the mice in Group pcDNA3-W2b2a +Astragalustreatment lived longer than those in Group pcDNA3-W2b2a, Group pcDNA3 +Astragalustreatment, and GroupAstragalustreatment (P<0.05).Astragaluscan strengthen the immunomodulatory effect on immune mice from the epitope vaccineswx2b2a ofT.gondiiagainst acuteT.gondiiinfection.

Toxoplasmagondii; epitope vaccine;Astragalus; immunomodulatory

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.008

舒衡平，Email: hengpingshu@xysm.net

1.湖南环境生物职业技术学院，衡阳 421001； 2.中南大学湘雅医学院，长沙 410078

Supported by grants from the Special Foundation of Forestry Science and Technology Innovation of Hunan (No. XLK201432), the Science and Technology Project of Hunan (No. 2014FJ3126), the Social Science Fund of Hengyang (No. 2014D100), the Science and Technology Development Project of Hengyang (No. 2014KJ27)

R382.5

A

1002-2694(2015)09-0822-04

2015-02-15；

2015-07-20

湖南省林业科技创新专项资金(No.XLK201432),湖南省科技计划项目(No.2014FJ3126),衡阳市社会科学基金(No.2014D100),衡阳市科学技术发展计划项目(No.2014KJ27)联合资助