肠侵袭性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

李丹丹，徐义刚，邱索平，王 昱，高会江，高慎阳

肠侵袭性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

李丹丹1，徐义刚2，邱索平3，王 昱4，高会江5，高慎阳6

目的 为建立肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)的DPO-PCR快速检测方法。方法 本研究以EIECipaH基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸(DPO)引物，建立了EIEC DPO-PCR检测方法。结果 退火温度范围在47℃～67℃内都能有效地扩增出目的基因，表明该检测方法对退火温度不敏感；该DPO引物仅与EIEC的扩增反应呈阳性，而与其他菌株无非特异性扩增反应，表明该方法特异性强；该方法的灵敏度为1.17×102cfu/mL。利用该检测方法对采集的230份样品进行检测，共计检出3份EIEC阳性样品，与国标法(GB 4789.6-2003)检测结果一致，显示了良好的实用性。结论 该DPO-PCR 方法设计简单、特异性强，具有良好的实用性。

肠侵袭性大肠杆菌；ipaH基因；DPO-PCR

肠侵袭性大肠杆菌(EnteroinvasiveE.coli, EIEC) 是致泻性大肠杆菌中的一种致病类型，能够引起人和动物胃肠感染性疾病的重要病原菌[1-3]，是一种重要的人畜共患病致病菌，此外EIEC还是国际公认的食物中毒病原菌，其引发的食源性疾病已成为当前全球面临的公共卫生问题之一[4-6]。因此，建立快速并且准确的检测方法对防止EIEC的感染和提高EIEC的检测效率具有重要意义。

双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide，DPO)设计简单，不需要对退火温度进行优化及对引物进行筛选，简化了常规PCR方法引物设计的步骤[7-10]；另外，DPO引物比常规PCR引物的特异性更强，碱基错配发生3个或以上，扩增就会停止[11-12]，所以检测结果要比常规PCR方法检测结果更为精确。本研究利用该技术，建立了EIEC DPO-PCR快速检测方法，为有效检测EIEC提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及临床样品 空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希菌O157∶H7、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、变形杆菌、阪崎肠杆菌、粘质沙雷菌、大肠埃希菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、肠致病性大肠杆菌和肠侵袭性大肠杆菌等标准菌株购自于美国典型菌种保藏中心；肠侵袭性大肠杆菌分离株由本中心实验室分离保存。230份临床样品采自畜禽饲养场和市场流通食品，包括牛肉、鸡肉、猪肉、生牛奶、蔬菜、水果、牛肉制品、猪肉制品及牛奶制品等。

1.1.2 主要试剂 细菌培养基和增菌培养基BPW均购自广东环凯微生物科技有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2均购自宝生物工程大连有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank 公布的EIECipaH基因序列(JQ638638.1) 中的保守序列，设计常规引物和DPO引物各一对，扩增片段大小均约为210 bp，两对引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

常规引物基因序列：

ipaH-CGF 5′-TTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTG-3′

ipaH-CGR 5′-GTCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTTCC-3′

DPO引物基因序列：

ipaH-DPOF 5′-TTTCGATAATGATACCGGCGCIIIIITCTCCCTG-3′

ipaH-DPOR 5′-GTCACTCCCGACACGCCATIIIIICGCATTTCC-3′

1.2.2 DNA模板的制备 将1.1.1节中的菌株分别接种到5 mL增菌培养基BPW中，增菌培养12 h后，取1 mL菌液按照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，-20 ℃保存备用。临床样品的检测采用煮沸法提取细菌DNA。

1.2.3 DPO-PCR反应条件的优化及电泳分析 对DPO-PCR反应体系中的各项反应参数和循环参数进行优化，筛选出DPO-PCR反应中最佳反应模式。

1.2.4 DPO-PCR退火温度不敏感性检测 将退火温度范围设为47 ℃～67 ℃，进行DPO-PCR和常规PCR扩增试验，产物于1.0 %琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.5 DPO-PCR特异性检测 利用建立的DPO-PCR检测方法对1.1.1节中的菌株进行扩增，产物于1.0 %琼脂糖凝胶电泳分析，验证方法的特异性。

1.2.6 DPO-PCR灵敏性检测 提取EIEC基因组DNA并测定浓度，10倍倍比稀释DNA，原液至10-1～10-6，根据试剂盒提取每级稀释度细菌DNA，各取2 μL作为模板进行DPO-PCR扩增。

1.2.7 DPO-PCR检测方法的初步应用 将采集来的230份临床样品(25份牛肉、30份鸡肉、25份猪肉、20份生牛奶、40份蔬菜、35份水果、15份牛肉制品、20份猪肉制品、20份牛奶制品)经过处理匀浆后，均用营养肉汤增菌培养6 h，增菌液煮沸法提取DNA 并进行DPO-PCR 扩增，所得检测结果用国标法(GB 4789.6-2003)进行复检，以验证所建立的DPO-PCR方法的可靠性。

2 结 果

2.1 EIEC DPO-PCR检测方法的确定 通过对DPO-PCR反应体系中各个反应参数和循环参数的优化，最终确定了EIEC最佳DPO-PCR反应模式。在20 μL反应体系中含有：10×PCR 缓冲液2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，dNTP混合物(2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2.0 μL，去离子水补充至20 μL。反应程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，25个循环；72 ℃ 10 min。对琼脂糖凝胶电泳分析获得了约210 bp的目的片段。(图1)。

M：DNA marker 100 ladder；1～2：EIECipaH基因；3：水对照.

M：DNA marker 100 ladder；1-2：EIECipaHgene；3：Negative control.

图1 EIECipaH基因DPO-PCR扩增结果

Fig.1 DPO-PCR products of EIECipaHgene

2.2 DPO-PCR退火温度不敏感性 退火温度设定在47 ℃～67 ℃范围内，由图2左边1-10可以看出，DPO-PCR均能有效扩增出EIECipaH基因，说明DPO-PCR退火温度范围较宽并且对退火温度不敏感，而常规PCR扩增效果较差，存在最佳的退火温度(图2右边1-10)。

2.3 DPO-PCR和常规PCR方法特异性扩增结果 利用建立的DPO-PCR检测方法和常规PCR方法对1.1.1节中的菌株进行扩增，结果显示：以ipaH基因为靶基因进行扩增，只有EIEC及其分离株扩增出约210 bp特异性条带，其它菌株均未出现任何扩增条带(图3)，由图中可以看出DPO-PCR方法的检测特异性要比常规PCR方法检测特异性要强。

M：DNA marker 100 Ladder；1-10：46.9 ℃，48.6 ℃，50.4 ℃，52.8 ℃，55.4 ℃，58.1 ℃，60.7 ℃，63.1 ℃，65.1 ℃，67 ℃；左边(1-10)DPO-PCRipaH基因扩增结果；右边(1-10)为常规PCRipaH扩增结果.

M：DNA Marker100 ladder；1-10：Annealing temperature of 46.9 ℃，48.6 ℃，50.4 ℃，52.8 ℃，55.4 ℃，58.1 ℃，60.7 ℃，63.1 ℃，65.1 ℃，67 ℃，respectively；DPO-PCR products ofipaHgene，left (1-10)；PCR products ofipaHgene，right (1-10).

图2 退火温度对PCR扩增的影响

Fig.2 Effect of annealing temperature on PCR amplification

A：DPO-PCR特异性试验检测结果；B：常规PCR特异性试验检测结果. M：DNA marker 100 ladder；1：EIEC；2：EIEC分离株；3：肠出血性大肠杆菌O157:H7；4：肠致病性大肠杆菌；5：产肠毒素大肠杆菌；6：粘质沙雷菌；7：沙门氏菌；8：金黄色葡萄球菌；9：志贺氏菌；10：空肠弯曲菌；11：小肠结肠炎耶尔森氏菌；12：单核细胞增生李斯特氏菌；13：变形杆菌；14：大肠埃希菌；15：阪崎肠杆菌；16：霍乱弧菌；17：创伤弧菌.

A：Specificity of DPO-PCR detection of EIEC；B：Specificity of PCR detection of EIEC；M：DNA marker 100 Ladder；1：EIEC；2：EIEC isolate；3：EscherichiacoliO157:H7；4：EnteropathogenicE.coli；5：EnterotoxigenicE.coli；6：Serratiamarcescens；7：Salmonella；8：Staphylococcusaureus；9：Shigella； 10：Campylobacterjejuni；11：Yersiniaenteroxolitica；12：Listeriamonocytogenes；13：Proteusbacillusvulgaris；14：Escherichiacoli；15：Enterobactersakazakii；16：Vibriocholerae；17：Vibriovulnificus.

图3 EIEC DPO-PCR和PCR特异性试验检测结果

Fig.3 Specificity of DPO-PCR and PCR detection of EIEC

2.4 DPO-PCR方法检测的灵敏度 10倍系列稀释菌液按试剂盒提取每级稀释度细菌DNA，按2.1优化出的DPO-PCR反应条件进行检测，结果表明在20 μL反应体系中，模板DNA加入2 μL，菌体浓度自1.17×108cfu/mL至1.17×102cfu/mL均可扩增出清晰条带，菌体浓度为1.17×101未扩增出条带(图4)，表明本实验建立的DPO-PCR方法检测EIEC灵敏度为1.17×102cfu/mL。

M：DNA marker 100 Ladder；1-9：DPO-PCR扩增片段(菌液稀释:依次为1.17×108-1.17×100cfu/mL.)

M：DNA marker 100 Ladder；1-9：amplified fragments of DPO-PCR (EIEC serially diluted from 1.17×108-1.17×100cfu/mL) .

图4 EIEC菌液稀释法DPO-PCR敏感度检测结果

Fig.4 Sensitivity of DPO-PCR for detection of EIEC dilution

2.5 DPO-PCR检测临床样品的实验结果 利用建立的EIEC DPO-PCR检测方法对采集的230份临床样品进行检测，检测出3份阳性样本，所得检测结果用国标法(GB 4789.6-2003)进行复检，两者检测结果的一致率为100%，显示该方法具有很好的可靠性。

3 讨 论

目前，包括我国在内的绝大多数国家针对食源性致病菌的检测仍主要依靠传统细菌分离鉴定的方法，即首先利用选择性培养基增菌，进而结合生化及血清学方法进行鉴定。传统检测方法存在检测效率低、灵敏度低且耗时长、操作繁琐等不足。通常情况下，鉴定一种细菌需要5～7 d，而针对一些生化特性复杂的细菌，如单增李斯特氏菌的检测周期可长达20 d之久，严重影响了检测鉴定的周期，很难适应现代化食品安全快速检测的需要[13-14]。PCR技术具有快速、特异性强和灵敏度高等特点，是目前食源性致病菌检测主要采用的检测技术之一。在此基础之上，又相继发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术以及PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等，虽然能够满足快速检测的需求，但是对引物设计的要求很高，不仅需要对引物进行筛选，而且需要优化退火温度，增加了试验操作步骤，费时又费力。在本研究中，引入了新型的DPO引物设计方法，建立了EIEC DPO-PCR检测方法。

在本研究DPO-PCR退火温度不敏感性实验中，实验结果显示，退火温度设定在47 ℃～67 ℃范围内， DPO-PCR均能有效扩增出目标基因，说明DPO-PCR退火温度范围较宽并且对退火温度不敏感，而常规PCR扩增结果则受退火温度变化的影响较大，存在最佳退火温度；在DPO-PCR特异性实验中显示，建立的DPO-PCR能够准确地扩增出目标菌，其它菌株均未出现任何扩增条带，而常规PCR扩增效果的特异性相对较差，表明所建立的EIEC DPO-PCR检测方法特异性更强。临床样品检测结果表明，利用建立的EIEC DPO-PCR 检测方法能够对实际样品中的EIEC进行准确检测，与国标法(GB 4789.6-2003)的检测结果一致，具有良好的实用性。

本研究建立的DPO-PCR检测方法，DPO引物设计简单，简化了常规PCR引物设计步骤，提高了检测效率；并且由于DPO引物结构特殊具有比常规PCR引物更强的特异性，其检测结果要比常规PCR的检测结果更为准确，DPO-PCR检测方法的建立为EIEC快速精准的检测提供了新方法、新手段。

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Xu Yi-gang, Email: 108074182@qq.com

Development and application of DPO-PCR method for the detection of enteroinvasiveEscherichiacoli

LI Dan-dan1,XU Yi-gang2,QIU Suo-ping3,WANG Yu4,GAO Hui-jiang5,GAO Shen-yang6

(1.TechnicalCenterofHainanEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Haikou570311,China; 2.TechnicalCenterofHeilongjiangEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Harbin150001,China; 3.ConghuaEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Conghua510900,China; 4.TechnicalCenterofChongqingEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Chongqing404100,China; 5.LaboratoryofBovineGeneticsandBreeding,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 6.DepartmentofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China)

To establish a rapid assay for enteroinvasiveEscherichiacoli(EIEC) detection, a dual-priming oligonucleotide (DPO)-based PCR method was developed using the DPO primers targetingipaHgene of EIEC. Results showed that annealing temperature range at 47-67 ℃ can effectively amplify the target gene, primers were designed to show that the annealing temperature was not sensitive; in addition, the DPO-PCR method had high specificity due to special structure of DPO primers, thus no non-specific amplifications were produced in reaction; sensitivity of the method was 1.17×102cfu/mL. Furthermore, a total 3 positive samples for EIEC were detected from 230 clinical samples by the DPO-PCR method, which was in accordance with the testing result by GB/T 4789.6-2003 standard detection protocol. Therefore, the DPO-PCR method provides a novel, simple, rapid and sensitive detection method for EIEC infection. Keywords: EIEC;ipaHgene; DPO-PCR

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.009

海南省社会发展科技专项(2015SF29)；国家质检总局科技项目(2013IK031,2013IK051, 2015IK089)；重庆市科技计划项目(cstc2014yykfA80017)；海南省应用技术研究与开发专项项目(ZDXM20130025)；广东检验检疫局科技计划项目(2011GDK44，2013GDK04)

徐义刚，Email:108074182@qq.com

1.海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心，海口 570311； 2.黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，哈尔滨 150001； 3.从化出入境检验检疫局，从化 510900； 4.重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，重庆 404100； 5.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牛遗传育种研究室，北京 100193； 6.辽宁医学院畜牧兽医学院，锦州 121001

Supported by the Projects of Social Development Science and Technology in Hainan Province (No. 2015SF29), the Technology Projects of the State Quality Inspection Administration (Nos. 2013IK031, 2013IK051 and 2015IK089), the Program of Science and Technology in Chongqing Municipal (No. cstc2014yykfA80017), the Special Projects of Applied Technology Research and Development in Hainan Province (No. ZDXM20130025), the Technology Projects of Guangdong Quality Inspection Administration (Nos. 2011GDK44 and 2013GDK04)

S852.61

A

1002-2694(2015)09-0826-05

2015-02-27；

2015-07-20