利用响应面分析法优化葛根异黄酮提取工艺的研究

张宏川，刘思洋，王 蕾，顾 健，李佳川，谭 睿

(1.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041;2.西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

利用响应面分析法优化葛根异黄酮提取工艺的研究

张宏川1，刘思洋1，王 蕾1，顾 健1，李佳川1，谭 睿2

(1.西南民族大学民族医药研究院，四川 成都 610041;2.西南交通大学生命科学与工程学院，四川 成都 610031)

本文通过响应面分析方法确定葛根异黄酮最佳提取条件.以葛根异黄酮提取率为指标，利用响应面分析法分别以超声时间、乙醇浓度、料液比及提取时间等4因素为影响因子，考察各影响因子对葛根异黄酮提取率的影响.结果表明优化提取条件后葛根异黄酮的最佳提取工艺条件为:乙醇浓度为91.16%，超声时间16.59 min，料液比15.42:1，提取时间1.35 h.理论提取率为1.125 mg/g，实际测得提取率为1.025 mg/g.Box-Behnken实验设计方法可以较好地对葛根异黄酮提取工艺进行优化.

葛根;葛根异黄酮;响应面分析法

葛根(radix puerariae)为豆科植物野葛Pueraria Lobata(willd)Ohwi或葛粉P.Thomosonii Benth.葛根为常用中药，始载于《神农本草经》，近几年各方面对葛根中的多种有效成分研究比较活跃，其报道主要是对其药理活性以及在动物体内代谢特点进行探索.葛根药材中所含的主要成分为异黄酮类，如葛根素(Puerarin)、大豆黄酮(Daidzein)、大豆黄酮甙(Daidzin)、葛根素木糖甙(Puerarin-O-xyloside)、3’-甲氧基葛根素(3’-methoxy-puerarin)等［1］.葛根素的药理作非常用广泛，主要用于治疗心脑血管疾病;并且具有多种药理活性，其药用价值具有广阔的发展前景及重要的临床应用价值.目前利用响应面法优化葛根异黄酮提取工艺研究笔者未见文献报道.本次实验通过预实验考察确定4因素影响因子分别为:超声时间、乙醇浓度、料液比及提取时间，采用响应面分析软件中的Box-Behnken项设计建立有效数学空间模型［2-4］，以葛根异黄酮总提取得率作为唯一响应值，通过正式实验对葛根异黄酮总提取率的最佳提取工艺条件进行有效优化.

1 材料、仪器与方法

1.1 材料

中药购自成都荷花池药材市场.本品经西南民族大学民族药物研究所顾健教授鉴定为藤本植物野葛(Lobed Kudzuvine Root.)的块根，干燥根茎将其干燥、粉碎、过筛，存于干燥器中备用.

1.2 试剂及仪器

3’-羟基葛根素(批号:1409098)、3’-甲氧基葛根素(批号:1409112)、葛根素(批号:1411121，HPLC＞98%，成都康邦生物科技有限公司)、大豆苷(批号:13031404，HPLC≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司).乙腈、甲醇(色谱纯，Sigma公司).仪器 Waters高效液相色谱(包括1525型二元高压梯度泵系统、2695型二极管矩阵检测器、717增强型自动进样器、1500型柱温控制系统，Empower色谱工作站)(美国Waters公司);电子分析天平［XP6，梅特勒-托利多(上海)有限公司］;

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

InertSustain C18色谱柱(4.6 ×250 mm，5 μm);流动相为A甲醇-B 0.1%磷酸水，等度洗脱条件为A甲醇25%-B0.1%磷酸水75%.流速1 mL/min，检测波长250 nm;柱温30℃;进样量10 μL.在上述色谱条件下，3’-羟基葛根素、3’-甲氧基葛根素、葛根素、大豆苷、分离度及拖尾因子均符合含量测定要求.样品葛根总黄酮含量测定及对照品HPLC图见图1.

图1 葛根总黄酮样品(A)和对照品(B)的HPLC图谱1.3’-羟基葛根素;2.3’-甲氧基葛根素;3.葛根素;4.大豆苷Fig.1 Pueraria total flavonoids sample(A)and reference(B)of the HPLC chromatogram1.3＇-hydroxy-Puerarin;2.3’-methoxy-puerarin;3.Puerarin;4.Daidzin

1.3.2 对照品溶液制备

分别精密称取 3’-羟基葛根素 12 mg、3’-甲氧基葛根素20 mg、葛根素23 mg、大豆苷32 mg、将对照品置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得到质量浓度分别为 0.12，0.20，0.23，0.32mg/mL 的各对照品储备液.分别吸取上述对照品储备液3’-羟基葛根素2mL、3’-甲氧基葛根素2mL、葛根素2 mL、大豆苷2 mL、于10 mL量瓶中，作为混合对照品储备液.

1.3.3 样品制备

取处理好葛根粉末2g，按照Design-Expert 8.0.6统计分析软件设计实验组进行29次试验，将得到葛根浸膏定容溶于50mL色谱甲醇，摇匀取1mL溶液定容于5mL容量瓶中制的样品溶液.

1.3.4 标准曲线制备

分别精密量取标准品3’-羟基葛根素0.10，0.30，1.00，1.50，2.50 mL;3’-甲氧基葛根素 0.30，0.40，0.50，0.60，0.70 mL;大豆苷 0.50，0.80，1.00，1.40，1.60，mL;置于 5 mL 容量瓶中，葛根素 0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL;置于1mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，分别精密吸取对照品储备液各10 μL，按上1.3.1谱条件进行测定，以峰面积积分值(Y)与各异黄酮浓度(mg/mL)(X)进行标准曲线绘制.回归方程分为:y=7E+07x+21071(R2=0.9995)y=2E+07x-2E+06(R2=0.9996)y=6E+07x–204667(R2=0.9998)y=2E+08x–886343(R2=0.9995).结果表明 3’-羟基葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、葛根素分别在0.0072～0.0600，0.6000～1.4000，0.0320 ～0.1024，0.0092 ～0.0460 mg/mL线性关系良好.

1.3.5 葛根异黄酮最佳提取条件确定

对单因素影响因子进行预实验考察，利用Box-Behnken的中心组合设计原理，通过Design-Expert 8.0.6统计团建进行分析，设计出4因素3水平的响应面正式试验，得到响应面试验确切结果，获得葛根异黄酮最佳提取条件.试验因素与实验水平安排见表1.

表1 葛根异黄酮提取水平因素Table 1 Kudzu isoflavone extract level factor

2 结果与分析

以超声时间A、乙醇浓度B、料液比C和提取时间D为4因素影响因子，异黄酮总提取率为唯一响应值(Y)，利用响应面分析软件对实验数据进行分析.试验数据及方案见表2.

表2 葛根异黄酮响应面分析实验数据及方案法Table 2 Pueraria isoflavones response surface analysis methods of experimental data and programs

1-24号是析因实验，25-29号是中心实验.对表3中数据进行分析，可归纳出回归方程:Y=-4.57799+0.070223A+0.061492B+2.01937C+0.22166D-(5.63E-05)AB-(6.15E-04)BD-(3.95E-03)BC+(1.05E-03)AD-0.0123AC+0.0481CD-(9.74E-04)A2-(3.19E-04)B2-1.03677C2-(6.91E-03)D2，各个实验因素的方差分析结果见表3.

表3 葛根异黄酮各因素方差分析数据Table 3 Pueraria isoflavones each ANOVA data

由数据表3进行分析可得出“Prob＞F”值＜0.01，可表明方程拟合度较为显著，失拟项所对应的F值为1.54，表明失拟项相相对于纯误差项不表示显著.超声时间(A)、乙醇浓度(B)的“Prob＞F”值小于0.01，可证明其影响因子对异黄酮得率影响非常明显，对于葛根异黄酮响应值所对应各因素影响大小可安排为:超声时间＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比.二次方影响因子 A2、B2、C2的 Prob ＞F 值都 ＜0.0001，两因素交互项BD、AB、CD、BC、AD、AC，其中 AC 项的 Prob＞F 值为0.0003较为显著，由此表数据分析可以得出4个影响因子分别相对于葛根异黄酮的提取效率不是简单平面图形所能表示出来的，如图2.

如图2所示响应面图形中的Y值对应的各因素A、B、C、D构成的一个三维空间的等高图，可以直观地在二维空间平面上反映各因素的两两交互作用以及对响应值的影响.决定系数R2=0.9543，C.V.%=6.24，Adj R-Squared=0.9086说明响应面模型拟度较好合好，实验数据误差较小，在可控范围之内，因此可以利用此模型及条件对葛根异黄酮提取率进行较好的优化［5-6］.

通过响应面实验得出葛根异黄酮提取的最佳工艺条件:乙醇浓度为91.16%，超声时间16.59 min，料液比15.42:1，提取时间1.35 h，葛根异黄酮理10 μL进样量论提取率为1.125 mg/g.考虑实际操作以及各方面客观因素影响，将葛根异黄酮的提取条件在分析软件所得出理论值基础可以上进行误差内的修正:液固比15:1乙醇浓度90%，，提取时间为1.4h，超声时间17 min，在修正优化后的条件下共进行3次平行验证实验［7］，实际测得葛根异黄酮总得率结果见表4.实验结果葛根异黄酮含量为与理论值差值较小.3次验证实验可表明利用响应面分析法设计的方案所得到的有效数据有较好的可靠性［8-10］.

表4 葛根异黄酮验证试验结果Table 4 berberine alkaloids validation test results

3 讨论

传统的数理统计方法一般采用正交设计，不能在进行试验的整个区域上找到影响因素和响应值之间的明确的函数表达式.响应面分析法能有效避免正交设计只能处理离散的水平值.通过数据分析及软件所得回归方程Y=-4.57799+0.070223A+0.061492B+2.01937C+0.22166D-(5.63E-05)AB-(6.15E-04)BD-(3.95E-03)BC+(1.05E-03)AD-0.0123AC+0.0481CD-(9.74E-04)A2-(3.19E-04)B2-1.03677C2-(6.91E-03)D2，能够有效在空间体现出各个单因素对于提取葛根总黄酮含量影响大小及主次顺序.各因素A、B、C、D构成的一个三维空间的等高图，可以直观地在二维空间平面上反映各因素的两两交互作用以及对响应值的影响.利用响应曲面分析法中的Box-Behnken模型，对葛根总黄酮提取工艺最佳条件进行确定，得出最优影响因子数值［11-13］.修正后的工艺条件确定为:乙醇浓度90%，液固比15:1，超声时间17 min，提取时间为1.4h，理论得率1.125 mg/g，实际测得值为1.025 mg/g，高于各文献报道的葛根异黄酮提取含量.经过优化所得到的提取含量与相同条件下的平行实验理论提取含量相差甚小.由此可说明本实验通过响应面法优化所得到的葛根总黄酮最佳提取工艺条件技术是可靠的，并且可以为将来中试开发提供有力数据基础［14-16］.

图2 4因素影响因子相互作用对应响应值的空间立体图Fig.2 4-dimensional space corresponding to the interaction of factors affecting the response factor values figure

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Isoflavones extraction technology optimized by response surface methodology

ZHANG Hong-chuan1，LIU Si-yang1，Wang Lei1，GU Jian1，LI Jia-chuan1，TAN Rui2
(1.Institute of Ethnic Medicine，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，P.R.C.;2.School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031，P.R.C.)

The article identified the optimum conditions for the extraction of isoflavones via response surface analysis.Based on the pueraria isoflavone extraction rate index，response surface analysis method was used to four factors including ultrasound time，ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time，and to inspect each factor on the extraction rate of isoflavones.The results showed that the optimized extraction conditions of isoflavones were as follows:ethanol concentration was 91.16%，ultrasonic time 16.59，liquid ratio 15.42:1，extraction time 1.35 h;Theoretical extraction rate of 1.125 mg/g;The actual extraction rate measured reached 1.025 mg/g.Box-Behnken experimental design method can optimize the extraction technology of isoflavones.

pueraria;isoflavones;response surface methodology

R284

A

2095-4271(2015)06-0695-06

10.11920/xnmdzk.2015.06.007

2015-09-28

顾健(1967-)，男，汉族，教授，博士生导师，主要从事中药及民族药物开发与研究，E-mail:gujiancd@163.com

国家“重大新药创制”科技重大专项(2013ZX09103-002-014);西南民族大学研究生学位点建设项目(2015XWDS0703);西南民族大学研究生“创新型科研项目”(CX2015SZ036)

(责任编辑:李建忠，付强，张阳，罗敏;英文编辑:周序林，郑玉才)