HPLC-DAD法同时测定消乳增胶囊的三种活性成分*

王 锐，陆 铖，葛 斌，袁继勇，高庆剑，汤 浩△

1甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000；2宁夏医科大学药学院

HPLC-DAD法同时测定消乳增胶囊的三种活性成分*

王 锐1，2，陆 铖1，2，葛 斌1，袁继勇1，高庆剑1，2，汤 浩1△

1甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000；2宁夏医科大学药学院

目的：建立HPLC-DAD法同时测定消乳增胶囊中的多种活性成分。方法：采用DAD全波长扫描，色谱柱为Gemini C18(250mmx4.60mm,5μm)，流动相为乙腈，甲醇为10：90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)梯度洗脱，流速为0.8mL/min；检测波长为280 nm。结果：甘草苷线性范围为1.25～40μg/mL，平均回收率为98.51%，RSD为0.81%；橙皮苷线性范围为2.5～80μg/mL，平均回收率为98.10%，RSD为1.32%；欧前胡素线性范围为5～160μg/mL，平均回收率为98.92%，RSD为0.76%。结论：该HPLC-DAD方法能有效测定消乳增胶囊中甘草苷、橙皮苷及欧前胡素的主要活性成分含量，且快速、准确。

HPLC-DAD；“消乳增”胶囊；橙皮苷；甘草苷；欧前胡素

消乳增胶囊由甘肃省人民医院自主研发，临床应用10余载，由甘草、青皮、陈皮、白芷等17味中药组成，具有行气解瘀、调节内分泌失调的功能，常用于治疗乳痈、乳腺增生症等。经多年临床使用，现已在处方改进方面积累了经验，鉴于仅对白芍有效成分芍药苷建立了H P L C测定方法［1］，已不能满足制剂改进后的全面质控和药效学机制深入研究的要求，本研究采用H P L C-D A D法优选色谱条件，最终选取以甘草苷、橙皮苷、欧前胡素为指标的多种活性成分色谱同时定量方法，为该制剂的进一步改进及质量控制等方面提供方法学支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 美国A g il e n t公司1100系列高效液相色谱仪(配置G1312A二元梯度泵、G1313A自动进样系统、G1315B二极管阵列检测器及A g il e n t C h e m S tat i o n f or L C 3D R e v A.10.02色谱工作站)；电子分析天平［梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司］；超声清洗仪(上海科导有限公司)。

1.2 试剂 消乳增胶囊(甘肃省人民医院自制，批号：20101108)；橙皮苷对照品(批号：110721-201014)、甘草苷对照品(批号：111610-201057)、欧前胡素对照品(批号：110826-201013)均购自中国食品药品检定研究院；三蒸水为自制；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱G e m ini C18(250mm×4.60mm，5μm)柱；流动相为乙腈；甲醇=10∶90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脱，20%A(0～5m in)，20%～40%A(5～10 m in)，40%A(10～15 m in)，40%～60%A (15～20m in)。60%A(20～50m in)；流速为0.8m L/m in；检测波长为280 n m；柱温为室温，见图1。

图1 消乳增三种指标成分同时测定色谱图

2.2 对照品溶液的制备 精密秤取甘草苷、欧前胡素各20m g置于10m L容量瓶中，取橙皮苷20m g置于100m L容量瓶中，分别用甲醇溶解并定容至刻度，得单一对照品溶液。分别取0.1m L甘草苷对照品溶液，2m L橙皮苷对照品溶液，0.4m L欧前胡素对照品溶液，置于5m L容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得混合对照品溶液。

2.3 样品溶液的制备 取20粒消乳增胶囊内容物，混合均匀，精密秤取粉末0.5 g置于5m L容量瓶中，用甲醇超声30分钟溶解，待溶液放冷，用甲醇定容至刻度，滤纸过滤，进样前用0.45μm滤膜过滤，既得样品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备 按消乳增胶囊处方量取无甘草、青皮、陈皮、白芷的药材，按消乳增胶囊制备方法制备阴性样品，再按“2.3”项下样品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察 取混合对照品溶液作为“1号”对照溶液，采用倍比稀释法，精密吸取“1号”对照溶液1m L于2m L容量瓶中，加甲醇定容至刻度得到“2号”混合对照溶液，依次配出“3号”“4号”“5号”“6号”混合对照溶液。精密吸取各混合对照溶液20μL进样，进行色谱测定，按“2.1”项下色谱条件进行色谱分析，以进样量(Y，μg/m L)对峰面积(X，A)进行线性回归，分别得甘草苷回归方程为y=54.205x+14.396，r=0.999 5，n=6，线性范围为1.25～40μg/m L；橙皮苷回归方程为y=34.593x+72.438，r=0.999 4，n=6，线性范围为2.5～80μg/m L；欧前胡素的 回归方程为y=28.895x+147.77，r=0.9992，n=6，线性范围为5～160μg/m L。

2.6 稳定性实验 取同一样品，按“2.3”项制备样品溶液，依“2.1”项的色谱条件进样，分别在0、4、8、12、16、24小时进样，测定峰面积。结果：甘草苷峰面积的RS D=0.78%；橙皮苷峰面积的RS D=1.09%；欧前胡素峰面积的RS D=2.38%。

2.7 精密度实验 精密吸取同一浓度混合对照溶液，按“2.1”项色谱条件，重复进样5次，测定峰面积，结果甘草苷峰面积的RS D=1.67%；橙皮苷峰面积的RS D=2.42%；欧前胡素峰面积的RS D=1.28%。

2.8 重现性实验 取同一批次样品6份，按“2.3”项制备样品溶液，依“2.1”项色谱条件进样，测定峰面积，结果甘草苷峰面积的RS D=1.47%；橙皮苷峰面积的RS D=0.69%；欧前胡素峰面积的RS D=2.15%。

2.9 加样回收实验 精密秤取干燥至恒重的消乳增胶囊粉末0.5g精确加入一定量的对照溶液，按“2.3”项下制备方法制备样品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样20μL，结果见表1—3。

表1 甘草苷的回收率

表2 橙皮苷的回收率

表3 欧前胡素的回收率

2.10 样品含量测定 精密秤取3批消乳增胶囊各3份，每份0.5 g，按“2.3”项下制备方法制备样品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样20μL，计算甘草苷、橙皮苷、欧前胡素的含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

消乳增胶囊在我院临床应用多年，发挥了特色中药制剂的优良品质，弥补了西医治疗乳腺增生疗效的不足。依成方组分特点，甘草具有补脾益气，清热解毒，缓急止痛，调和诸药的作用，其活性成分甘草苷具有解痉和抗肿瘤作用［2-3］；陈皮具有降气宽中，健脾温胃的功效，其活性成分橙皮苷有神经保护和抗纤维化作用［4-5］；白芷具有祛风除湿，通窍止痛，消肿排脓的功效，其活性成分欧前胡素具有血管舒张、抗肿瘤及缓解痛经的作用［6-8］。本研究采用H P L C法同时对3种君药有效成分甘草苷、橙皮苷、欧前胡素的含量进行测定，所建方法快捷、准确，有利于“消乳增”胶囊的质量控制及组方改进后药效物质基础的进一步研究。

在实验中参考相关文献［8-14］，以优化橙皮苷和甘草苷的分离度，考察了多种流动相体系，如甲醇∶水系统，乙腈∶水系统，甲醇∶冰醋酸∶水系统，乙腈∶冰醋酸∶水系统，乙腈∶甲醇∶冰醋酸∶水系统等，比较各个组分的保留时间和分离度，结果显示在乙腈∶甲醇=10∶90(A)-0.5%冰醋酸水溶液(B)条件下最好。以基线分离为原则，对不同梯度洗脱程序进行优化。确定最终洗脱程序为20%A(0～5m in)，20%～40%A(5～10m in)，40%A(10～15m in)，40%～60% A(15～20m in)，60%A(20～50m in)；以上条件下消乳增胶囊能够排除杂质峰的干扰，达到基线分离，见图2—3。

图2 色谱流动相体系筛选

图3 色谱流动相梯度筛选

本实验利用D A D多波长扫描功能，对多种活性成分进行最大吸收波长的优化，在280 n m时由于基线稳定、重复性高，故选其为检测波长。该方法同时能对复方中药的3种活性成分进行定量，定量指标更全面，结果准确、可靠，更具参考意义。

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Determ ination of Three Active Com ponents in XiaoRuZeng Capsulesby HPLC-DAD M ethod

WANG Rui1,2,LU Cheng1,2,GE Bin1,Yuan Jiyong1,GAO Qingjian1,2,TANG Hao1△
1 Pharnacy Departmentof Gansu People′s Hospital,Lanzhou 730000,China; 2 Pharmacy College of Ningxia Medical University

Objective:To determine themulti-active components in XiaoRuZeng capsules by a HPLC-DAD method.Methods:W ith DAD fullwavelength scan,the determ ined conditionswere follows:chromatographic column:Gem iniC18(250mm×4.60mm);mobile phase:acetonitrite/methanol(10:90)(A)and 0.5%acetic acid(B) w ith gradientelution;flow rate:0.8m L/min;detection wavelength:280 nm.Results:The results revealed that the linear range of liquiritin was 1.25～40μg/m L,the average recovery 98.51%aswell as RSD 0.81%,the linear range ofhesperidinwas2.5～80μg/m L,the average recovery 98.10%aswellas RSD 1.32%and the linear range of imperatorin was 5～160μg/m,the average recovery 98.92%aswellas RSD 0.76%.Conclusion:The HPLC-DAD method isaccurate and easy in determining themain componentsof XiaoRuZeng capsules like hesperidin,liquiritin and imperatorin.

HPLC-DAD;XiaoRuZeng capsules;hesperidin;liquiritin;imperatorin

R285

A

1004-6852(2015)03-0025-04

2014-08-28

甘肃省中医药科研立项课题(编号GZK-2010-4)；甘肃省省自然科学研究基金计划项目(编号1107RJZA130)。

王锐(1990—)，男，在读硕士研究生。研究方向：中药药效物质基础研究。

△通讯作者：汤浩(1975—)，女，博士学位，硕士研究生导师，副主任药师。研究方向：医院药学和中药新药开发。