金锁二仙口服液的提取纯化工艺优选

刘光斌，毛和平，谢六生，任 远

1酒钢医院，甘肃 嘉峪关 735100；2甘肃中医学院

金锁二仙口服液的提取纯化工艺优选

刘光斌1，毛和平1，谢六生1，任 远2

1酒钢医院，甘肃 嘉峪关 735100；2甘肃中医学院

目的：优选金锁二仙口服液的提取纯化工艺。方法:采用均匀设计法，以PEG400浓度、提取时间、溶剂用量、提取次数为主要考察因素，以总黄酮提取量为考察指标优化提取工艺；采用正交实验法，以提取液浓缩程度、澄清剂用量、澄清温度为主要考察因素，以总黄酮损失率为指标优选澄清工艺。结果:最佳提取工艺为采用PEG400浓度为2.8%的水溶液提取，每次7倍量，提取60分钟，提取2次；优选纯化工艺为提取液浓缩至药材质量的5倍，在60℃温度下用0.12‰ZTC1+1天然澄清剂澄清。结论:该提取纯化工艺合理、可行,适合工业生产的需要。

金锁二仙口服液；总黄酮；提取工艺；纯化工艺；均匀设计；正交实验

金锁二仙口服液是根据酒钢医院经验方［1-3］自行研制的中药制剂。由金樱子、锁阳、淫羊藿、仙茅等药组成，具有补肾固精之功效。临床用于治疗早泄、阳痿、性欲低下、射精无力、腰膝酸软或酸痛、疲乏困倦等。为保证该制剂质量和临床疗效的稳定性，本研究采用均匀设计优选药材的提取工艺，采用正交实验设计优化澄清(纯化)工艺，从而综合选择金锁二仙口服液的生产工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 756紫外可见分光光度计(上海奥谱勒仪器有限公司)；A U W120D型电子分析天平(日本岛津，十万分之一)；超纯水仪(杭州天创净水设备有限公司)。

1.2 试药 芦丁对照品(批号：100080-200707，供U V法含量测定用，含量为92.5%)购自中国药品生物制品检定所；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。药材均购自甘肃省酒泉市培丰中药材生态种植加工公司，经嘉峪关药品检验所中药室鉴定符合2010版中国药典药材项下标准规定。

2 方法与结果

2.1 提取工艺研究

2.1.1 总黄酮的含量测定

2.1.1.1 测定波长的选择 用芦丁对照品溶液0.104m g/m L，随行试剂为空白，在200～700 n m波长范围扫描。结果供试品溶液与对照品溶液均在359 n m波长处有最大吸收，与相关文献［4］报道的360 n m相近，故确定测定波长为359 n m。

2.1.1.2 标准曲线的制备 取芦丁对照品约10.0m g，精密称定，乙醇溶解定容于100m L容量瓶中，摇匀；精密量取0、1、2、4、6、8、10m L分别置于10m L容量瓶中，乙醇定容，摇匀；以第一个样品为空白，于359 n m处测定各对照液吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标回归分析，得回归方程：A=12.953C+0.0058，R2=0.9997(n=6)，线性范围为10.4～104.0μg/m L。

2.1.1.3 精密度实验 取最低浓度标准液依法测定其吸收度(n=5)，RS D为0.81%。

2.1.1.4 供试品的制备 取5.0 g聚酰胺装柱(长30 c m，内径1.8 c m)，精密称取供试品0.2 g，干法上柱，用5m L纯化水润湿聚酰胺柱上部，3小时后再加纯化水5m L，使柱底部聚酰胺完全润湿，过夜；先用纯化水洗至洗脱液无色，再用50m L乙醇以1m L/m in速度洗脱，洗脱液收至50m L容量瓶中，乙醇定容，备用。

2.1.1.5 重复性实验 依法对同一样品6次独立测定吸收度，RS D为1.68%。

2.1.1.6 加样回收率实验 精密称取已知含量样品0.2 g，6份，精密加入芦丁对照品适量(已知含量的80%、100%、120%)，按照供试品溶液制备方法制备样品溶液，测定，平均回收率为100.32%，RS D=1.34%。

2.1.1.7 样品溶液稳定性实验 取样品溶液，分别在 0、1、2、3、4小时测定吸收度，4小时内RS D=1.61%。

2.1.1.8 样品含量测定 分别取样品按“2.1.1.4”项制备样品溶液，测定吸光度，计算样品总黄酮含量。

2.1.2 提取工艺优选

2.1.2.1 药材吸水率测定 测定药材吸水率，以确定提取用水的最低水平值。按处方比例称取药材200 g，加水8倍浸泡，每隔30分钟观察一次浸透情况，直至药材浸至透心，滤出未被吸收的水液，称量湿药材，按吸水率公式吸水率(%)=［(浸泡后药材总量-浸泡前药材总量)/浸泡前药材总含量］×100%计算出本处方药材吸水率为220%。

2.1.2.2 因素及水平选择 以影响提取结果的P E G400浓度、提取时间、溶剂用量、提取次数等为主要参数，根据吸水率结果及药材中成分性质，设定因素水平见表1。

表1 因素水平

2.1.2.3 超滤工艺的优化 采用均匀设计法［5］，用U5(54)表设计实验。以总黄酮提取量为因变量Y，P E G400浓度(A)、总提取时间(B)、溶剂总量(C)、提取次数(D)为自变量，采用 S P SS13.0软件以bac k word方式进行多元线性回归［6-7］，得回归方程为Y=12.289+5.532C+1.276A(F=345.2，P＜0.05)，由回归方程可知，P E G400浓度、溶剂总量对实验结果有显著影响，总提取时间、提取次数对结果的影响无显著性。结合实验结果与生产实际，选择最优超滤工艺为P E G400浓度2.8%，总提取时间为120分钟，溶剂总量为14倍，提取次数为2次，见表2。

表2 超滤工艺的优化

2.1.2.4 工艺条件验证 通过重复试验将得到的最佳工艺条件进行验证，采用上述工艺评价体系考察工艺的稳定性。验证结果显示优化工艺条件总黄酮提取量高于其他任何一组，而且结果比较接近，提示所得工艺条件不但可行而且比较稳定，见表3。

表3 工艺条件验证表

2.2 澄清(纯化)工艺优化研究

2.2.1 澄清剂配制方法［8］Z T C1+1天然澄清剂由A、B两种组分组成。A组份配制：取A组份，加入100倍纯水中溶胀24小时，制成1%溶液；B组份配制：取B组份，加入100倍1%醋酸中溶胀24小时，即得。使用时将提取液保持在一定温度，先向其中加澄清剂B组份，每隔30分钟搅拌一次，2小时后加入A组份，30分钟后搅拌一次，过夜，300目滤布过滤。B组份与A组份的加入比例为2∶1。

2.2.2 因素及水平选择 为减少澄清剂用量，应对提取液采用减压浓缩工艺进行适度浓缩。以影响澄清结果的提取液浓缩程度、澄清剂用量、澄清温度为主要参数，设定因素水平见表4。

表4 因素水平

2.2.3 澄清(纯化)工艺优化实验 采用正交实验设计［9］表L934设计实验，以总黄酮损失率为工艺评价指标。结果表明在天然澄清剂总用量为0.12‰时效果最好，天然澄清剂的用量对黄酮损失率影响有显著性；由于浓缩程度和澄清温度对黄酮损失率影响无显著性，为节约成本和提高效率故选浓缩程度为5∶1，澄清温度为60℃。见表5—6。

表5 提取工艺优选正交实验

表6 提取工艺方差分析

2.2.4 澄清条件验证 以所得澄清条件处理提取液，验证澄清条件可行性及稳定性，结果显示实验1、2、3号黄酮损失率分别为3.3%、3.1%、2.9%，所得澄清条件可行且基本稳定。

3 讨论

处方中金樱子、锁阳、淫羊藿、仙茅、巴戟天、当归、甘草等药材中的黄酮类、多糖类、苷类等成分，在水中均有一定溶解度，因此可用大量水回流提取，但部分黄酮类成分在水中溶解度较小，在浓缩时随水的蒸发会以沉淀析出，采用药用级聚乙二醇400为2潜溶剂，与水组成混合溶液提取，与用水醇溶液提取相比，既可保证多糖的提取，又可防止水中溶解度较小成分析出。由于黄酮及其苷类为主要有效成分，因此选用总黄酮为工艺评价指标。

Z T C1+1天然澄清剂［10］作为一种天然高分子，其作用机制是利用电荷和大分子的架桥作用，去除溶液中的鞣质、蛋白质、树胶等杂质，得到稳定、澄清的溶液。由于本工艺所用溶剂溶解范围极广，为保证口服液有较好的澄明度，除去提取液中杂质，最终采用Z T C1+1天然澄清剂对提取液进行澄清处理。

本研究确定金锁二仙口服液的生产工艺为：取处方量药材，用P E G400浓度为2.8%的水溶液提取，每次用7倍量溶剂，提取60分钟，共提取2次，合并提取液；将提取液浓缩至药材质量的5倍得浓缩液，将浓缩料液在60℃温度下用0.12‰Z T C1+1天然澄清剂(0.08‰的B组分，0.04‰的A组分)澄清。澄清后料液放置24小时。对澄清的料液采用减压浓缩工艺浓缩至D1.05～1.06之间(料液体积的生药量为2∶1)，测定料液的比重；加入阿斯巴甜1.5‰、黄原胶0.8‰、苯甲酸钠3‰配料，灌封，100℃煮沸灭菌45分钟，贴签，包装，即得成品。

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［3］ 杜维祥，沈世林，马玉清.金锁二仙饮对雄性肾虚小鼠雄激素的调节作用［J］.中国中医药科技，2010，17(5)：393-394.

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Optim ization of Extraction and Purification Technology for JinSuo ErXian Oral Liquid

LIU Guangbin1,MAO Heping1,XIE Liusheng1,REN Yuan2
1 Jiugang Hospital,Jiayuguan 735100,China;2 Gansu University of Chinese Medicine

Objective:To optimize the extraction and purification technologies for JinSuo ErXian oral liquid. Methods:By uniform design,themain factors like PEG400 concentration,extracting time,solvent dosage and extracting times investigated,the totalamountof extracted flavonoidsas the inspecting index was used to optimize the extraction process;w ith the loss rate of total flavonoids as the index,the orthogonal testwas used to investigate the factors of precipitation process,such as the degree of concentrated extract,the amount of clarifying agent and the clarify temperature.Results:The optimum extraction technology was that the liquid was extracted w ith 2.8%aqueous solution the PEG400 concentration and 7 times the amountof each time for 60minutes and tw ice;the preferred purification processwas that the extracting solution was concentrated to five times the quality of the drugs and the liquid was purified w ith the 0.12‰ZTC1+1 natural clarifying agentat the temperature of60℃.Conclusion:The optimized extraction and purification technology for JinSuo ErXian oral liquid was reasonable,feasible and suitable for requirementsof industrialproduction.

JinSuo ErXian oral liquid;total flavonoids;extraction technology;purification technology; uniform design;orthogonal test

R282.4

A

1004-6852(2015)03-0037-03

2014-02-27

刘光斌(1970—)，男，主任药师。研究方向：药物分析、医院制剂及临床药学。