柚皮苷通过调控GSK-3β表达对糖尿病心肌病大鼠模型的心肌保护作用研究

黄瑞娜 吴铿 游琼 李腾 李上海 郭润民 闫海

柚皮苷通过调控GSK-3β表达对糖尿病心肌病大鼠模型的心肌保护作用研究

黄瑞娜 吴铿 游琼 李腾 李上海 郭润民 闫海

目的 明确柚皮苷是否通过调控糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)通路对抗糖尿病心肌病心肌损伤。方法 将60只大鼠随机分为对照组、糖尿病心肌病组(DCM组)、柚皮苷组、 TDZD-8(GSK-3β抑制剂)组, 各15例。各组经处理后, 检测血糖, 超声心动图检测左心室功能参数, 免疫组织化学检测心肌组织GSK-3β表达。结果 实验第12周, 与柚皮苷组、TDZD-8组比较, DCM组血糖升高, 左心室舒张期末内径(LVDD)、左心室收缩期末内径(LVDS)增大, 左心室射血分数(LVEF)下降, 差异有统计学意义(P<0.05)。结论 柚皮苷在有效调节糖代谢的同时, 下调GSK-3β表达而心功能恶化。

糖尿病心肌病；柚皮苷；糖原合成酶激酶3β；心功能

目前有研究显示, 抑制GSK-3β通路, 可有效改善大鼠糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)的症状［1］。近年来已有研究证实柚皮苷可有效防治糖尿病心肌病［2］。本实验以链脲霉素诱导的 DCM 大鼠模型为对象, 研究柚皮苷是否通过调控GSK-3β通路保护DCM心肌细胞。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级Wister 大鼠, 雄性, 体重150～180 g (合格证号SCXK 粤2006-0015), 由南方医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要药物与试剂 Naringin粉沫(广东省梅雁蓝藻公司, 纯度98%)；链脲佐菌素(美国SIGMA公司)；血糖试纸(强生“中国”医疗器材有限公司)；兔GSK-3βBeta多克隆抗体(上海恒斐生物科技有限公司)；TDZD-8(GSK-3β抑制剂) (上海甄准生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理 将60只Wister大鼠随机分为以下四组：对照组、DCM组、柚皮苷组、TDZD-8组, 各15只。对照组予普通饲料喂养, 其余均高糖高脂饲养6周, 在第6周时,对照组同时采用柠檬酸缓冲液腹腔注射, 一次性腹腔注射链脲佐菌素(ST.60 mg/kg, 临用前用0.1 mol/L枸橼酸缓冲液溶解, pH =4.2)腹腔注射；注射72 h后, 如连续2次空腹血糖>11.1 mmol/L 视为糖尿病模型成功。随后6周, 柚皮苷组每天予柚皮苷100 mg/(kg·次)灌胃1次, TDZD-8组每天静脉注射1次TDZD-81 mg/(kg·次), 对照组及DCM组每天予生理盐水灌胃1次。对照组继续予普通饲料喂养, 其余均继续高糖高脂饲养6周, 此时DCM模型成功。

1.2.2 左心室功能参数检测 使用GE Vividi便携式心脏彩超(探头频率为12 MHz)分别于动物造模前及实验第12周分别行超声心动图检查, 测量LVED、LVES、LVPWT及LVEF。每组数据均取连续3个心动周期的平均值。

1.2.3 心肌组织GSK-3β 免疫组织化学检测石蜡切片经兔GSK-3βBeta多克隆抗体, DAB 显色后, 采用Moti.6.0 数码医学图像分析系统测定阳性光密度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验各组大鼠空腹血糖的变化 一次性腹膜腔内注射小剂量链脲佐菌素72 h后, 柚皮苷组及TDZD-8组及DCM组血糖明显升高, 血糖>11.1 mmol/L, 可认为糖尿病模型造模成功。实验第12周, 柚皮苷组及TDZD-8组血糖降低,与DCM组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 超声心动图检测结果 DCM组12周时LVDD、LVDS增大, LVEF下降, 与动物造模前及对照组比较差异有统计学意义(P<0.05), 提示糖尿病心肌病模型制备成功。柚皮苷组及TDZD-8组LVDD、LVDS、LVEF等与动物造模前及对照组差异无统计学意义(P>0.05), 与DCM组12周时结果比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 各组空腹血糖比较±s, mmol/L)

表1 各组空腹血糖比较±s, mmol/L)

注： 与对照组比较,aP<0.05；与DCM组比较,bP<0.05

组别例数0周STZ i.p.后72 h12周对照组154.93±0.865.29±0.655.21±0.71 DCM组155.03±0.7315.44±1.88a18.64±4.85a柚皮苷组154.81±0.8814.64±1.45a12.17±2.77abTDZD-8组155.08±0.7016.05±1.99a12.81±2.93ab

表2 各组超声心动图比较(n=15,±s, mm)

表2 各组超声心动图比较(n=15,±s, mm)

注：与对照组比较,aP<0.05,bP>0.05；与DCM组比较,cP<0.05

项目时间对照组DCM组柚皮苷组TDZD-8组LVPWT0周2.33±0.242.13±0.332.28±0.212.19±0.2312周2.21±0.212.43±0.252.17±0.172.21±0.23 LVDD0.5.33±1.215.21±1.245.18±1.535.29±1.2312周5.30±1.1.6.88±1.69a.5.21±1.12bc.5.26±1.22bcLVDS0周3.33±1.223.41±1.343.29±1.283.39±1.1312周3.21±1.194.86±1.39a3.27±1.37bc3.32±1.28bcLVEF0周 0.70±0.170.73±0.130.69±0.210.71±0.1512周0.70±0.19 0.47±0.23a0.67±0.27bc0.68±0.21bc

2.3 心肌细胞GSK-3β的表达 采用CMIAS系列 Motic. Med6.0数码医学图象分析系统测量表示GSK-3β表达水平的阳性目标面光密度值, 柚皮苷组及TDZD-8组GSK-3β表达明显低于DCM组, 差异具有统计学意义(P<0.05)；DCM组高于对照组(P<0.05)。由此表明, 柚皮苷及GSK-3β抑制剂能够抑制GSK-3β表达。各组PKC的阳性目标面密度值的比较见表3。

表3 各组PKC的阳性目标面密度值的比较( χ-±s)

3 讨论

糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase3β, GSK-3β)是真核细胞内一种多功能丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶, 参与糖原合成酶、电压依赖性阴离子通道等50多种底物的活化［3］, 并参与调控糖代谢、 脂代谢、 细胞增殖和死亡等过程［4］。本研究中, DCM组较TDZD-8组血糖升高, 差异具有统计学意义(P<0.05), 心脏功能恶化。在大鼠DCM模型, 抑制GSK-3β通路, 可改善糖脂代谢和胰岛素作用减轻糖脂毒性；从而改善DCM的症状［1,2］。所以, 有效调控GSK-3β的表达对糖尿病心肌病的心肌保护具有重大意义。

近年来研究证实糖尿病心肌病经柚皮苷干预后心肌肥厚、心肌损伤、心力衰竭减轻, 同时柚皮苷作用效应具有剂量依赖性［2,5］。本研究显示柚皮苷及GSK-3β抑制剂在有效调节糖代谢的同时, 可改善心功能恶化, 而且两者间效应差异无统计学意义(P>0.05)。另外柚皮苷组及TDZD-8组GSK-3β表达较DCM组明显下降, 但两者间比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此作者认为柚皮苷通过有效调控GSK-3β表达而起到糖尿病心肌病心肌保护作用。

［1］ Yu W, Wu J, Cai F, etal. Curcumin alleviates diabetic cardiomyopathy in experimental diabetic rats. Plos One,2012.7(12):1411.

［2］ 游琼, 吴铿, 涂焰明, 等. 柚皮苷调控心肌核因子NF-κB 炎症信号通路对糖尿病心肌病大鼠防治作用 . 中国免疫学杂志,2013,29(2):121-124.

［3］ Martel C, Allouche M, Esposti DD, etal. Glycogen synthase kinase3-mediated voltage-dependent anion channel phosphorylation controls outer mitochondrial membrane permeability during lipid accumulation. Hepatology,2013.57(1):93-102.

［4］ Takahashi-Yanaga F. Activator or inhibitor? GSK-3 as a new drug target. Biochemical pharmacology,2013.86(2):191-199.

［5］ 吴铿, 黄瑞娜, 游琼, 等. 柚皮苷对糖尿病心肌病大鼠心肌的保护作用. 国际心血管病杂志,2012,39(5):302-305.

Research of protective effect by naringin for myocardium in diabetic cardiomyopathy rats by regulating expression of GSK-3β

HUANG Rui-na, WU Keng, YOU Qiong, etal.
Department of Cardiovascular Medicine, Affiliated Hospital of Guangdong Meidcal College, Zhanjian.524001, China

Objective To explore the approach of naringin in prevention of myocardial damage in diabetic cardiomyopathy by regulating expression of Glycogen synthase kinase3β (GSK-3β). Methods A total o.60 rats were randomly divided into control group, diabetic cardiomyopathy group (DCM group), naringin group, and TDZD-8 (GSK-3β inhibitor) group, and each group contained15 cases. Detections were made on blood glucose, left ventricular function parameters by ultrasonic cardiogram, GSK-3β expression in myocardial tissue by immunohistochemical method. Results In the12 weeks of experiment, DCM group had increased blood glucose, left ventricular diastolic diameter (LVDD), left ventricular diameter systolic (LVDS), and decreased left ventricular ejection fraction (LVEF) then the naringin group and TDZD-8 group. Their differences hadstatistical significance (P<0.05). Conclusion Naringin can effective regulate glycometabolism, along with reduce expression of GSK-3β for reduced cardiac function.

Diabetic cardiomyopathy; Naringin; Glycogen synthase kinase3β; Cardiac function

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.11.181

2015-03-20］

524001 广东医学院附属医院心血管内科

吴铿