宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验

赵清梅，余永涛，任 贤

（1.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021；2.国家民委发酵酿造工程生物技术重点实验室，宁夏银川750021；3.宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

奶牛子宫内膜炎是奶牛产后常发的繁殖障碍性疾病，不仅影响奶牛繁育性能，导致奶牛配种困难或长期不孕，还影响奶牛泌乳量［1］、增加饲养成本和淘汰率，给奶牛养殖业造成巨大经济损失［2］。奶牛子宫内膜炎主要由病原微生物感染引起，细菌、真菌、支原体、病毒、立克次体、滴虫等均可以引起奶牛子宫内膜炎，细菌是其主要病原菌［3］。引起奶牛子宫内膜炎的细菌多达数十种，以条件致病菌大肠埃希菌、葡萄球菌、链球菌等为主［4］。不同地区、不同牛场和抗生素的选用，致病菌的种类和比例相差较大［5-7］。宁夏地区气候适于奶牛养殖，奶牛养殖由最初的散户养殖为主逐渐发展为规模化养殖，1 000头以上大型奶牛养殖场不断出现。随着奶牛养殖规模的不断扩大，奶牛子宫内膜炎的发病率也不断升高。因此，宁夏奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定及其抗菌药物敏感性研究，对宁夏地区奶牛子宫内膜炎的防治具有重要意义。王桂琴等［8］从宁夏地区患病奶牛子宫内分离的金色葡萄球菌，对大部分抗菌药物产生了不同程度的耐药性。但引起宁夏地区奶牛子宫内膜炎的病原菌种类及其他病原菌的药物敏感性报道较少。本研究对宁夏银川市、吴忠市规模化牛场主要病原菌进行分离鉴定并研究其药物敏感性，为宁夏地区奶牛子宫内膜炎的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、甘露醇高盐琼脂、Baird-Parker（BP）琼脂、水解酪蛋白（MH）琼脂、营养肉汤为青岛海博生物技术有限责任公司产品；细菌生化编码鉴定管、药敏纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品；质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922为中国药品与生物制品检定所产品；DNA聚合酶、DNA Marker DL 2 000、DNA 提取试剂盒、凝胶回收试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备 S1000型PCR仪和Gel Doc XR凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集 2013年1月～2014年3月，选择宁夏银川市平吉堡国家奶牛园区、吴忠市金银滩国家奶牛园区6个规模化牛场78头经临床诊断为患子宫内膜炎的奶牛。将患牛保定，清理粪便后，用2%的新洁尔灭溶液清洗患牛外阴部，采用直肠把握法，向子宫内插入无菌输精管。在输精管的另一端接上25mL注射器，向子宫内注入无菌生理盐水并反复抽取数次，将抽取的液体注入已消毒的10mL离心管中，编号后置于冰盒中并尽快送至实验室进行细菌的分离培养。

1.2.2 病原菌的分离及初步鉴定 将子宫冲洗回收的液体接种于普通肉汤培养基中，37℃、200r／min振荡培养过夜。然后将培养液适当稀释后划线接种于麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、甘露醇高盐琼脂、BP琼脂、普通琼脂平板上，置37℃培养箱中培养12h～24h。观察单个菌落形态和生长特性，将菌落形态和生长特性相似的菌归为一类，并挑取其中部分单菌落涂片，经革兰染色后显微镜检，根据菌落和显微形态、生长特性等对分离的各菌株进行初步分类。

1.2.3 病原菌的生化鉴定 将纯化的各菌株接种于细菌生化鉴定管中，然后放入灭菌平皿，置37℃培养箱培养过夜，观察并记录生化反应结果，根据生化反应结果对各分离菌株进一步分类。

1.2.4 病原菌16SrDNA基因的扩增与序列分析选取形态特点和生化反应特性不同的大肠埃希菌菌株、葡萄球菌菌株、沙门菌菌株、链球菌菌株和棒状杆菌分别进行了16SrDNA序列的扩增和测定。用 TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取各菌株 DNA，应用引物Bacteria F2（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 Bacteria R2（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）［9］扩增细菌的16SrDNA序列。PCR反应体系为50μL，包括DNA聚合酶1.25U，PCR缓冲 液（含 有 Mg2＋）5μL，dNTP 4μL，引 物（20μmol／L）各1μL，模板 DNA 0.25μL；PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，58℃45s，72℃90s，30个循环；最后72℃10min。反应结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切取含有目的DNA 片段的琼脂糖凝胶，用TaKaRa Gel DNA purification Kit凝胶回收试剂盒纯化目的片段，将回收产物送上海英骏生物技术有限公司进行双向测序，测序引物与PCR反应引物相同。

将双向测序所得的16SrDNA序列拼接并剪去引物段，然后登陆NCBI数据库，分别将各菌株的16SrDNA序列与GenBank中已提交的菌株序列进行同源性比较。根据同源性比较结果，选择数据库中同源性较高的菌株序列和相关属菌株序列，应用 MEGA 4.0软件中的Clustal W程序进行序列排列，然后应用邻接法构建系统发育树。

1.2.5 病原菌的药物敏感性试验 采用纸片扩散法（K-B法）测定分离菌株对抗菌药物的敏感性。取纯化的大肠埃希菌和葡萄球菌各菌株分别接种于普通肉汤培养基中培养过夜，然后用无菌生理盐水将其稀释为1.5×108CFU／mL。用无菌棉签蘸取稀释好的菌液均匀涂布于MH平板表面，置培养箱中静置5min。然后用无菌镊子夹取各药敏片贴于平板表面。每个平皿放置3个～5个药敏片，每种药物设3个重复。将贴有药敏片的平皿置于37℃恒温箱中培养18h～24h，记录抑菌圈的直径。同时使用大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923作为质控菌，依据美国临床实验室标准化协会（CLSI）制定的标准［10］，通过抑菌圈直径的大小来判定病原菌对药物的敏感性，将其分为耐药（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）。药敏试验中未列入CLSI的部分抗菌药，其结果判定参考同类药物判断标准。

2 结果

2.1 病原菌分离和初步分类及生化鉴定结果

本试验共从78头患牛的子宫分泌物中分离出菌株117株，根据形态特点和生化鉴定结果，确定大肠埃希菌为65株，检出率为55.56%，葡萄球菌42株，检出率为35.90%，链球菌7株，检出率为5.98%，沙门菌2株，检出率为1.71%，棒状杆菌1株，检出率为0.85%。其中单一菌株感染的患牛为33头，感染率为42.31%，混合感染的患牛为41头，感染率为52.56%，另有4头没有分离出细菌（表1）。

此外，形态特点和生化鉴定结果表明，大肠埃希菌代表株4株，葡萄球菌代表株4株，沙门菌代表株2株，链球菌代表株2株，棒状杆菌代表株1株。

表1 奶牛子宫内膜炎病原菌分离和生化鉴定结果Table 1 Isolation and biochemical identification results ofpathogenic bacteria in dairy cows with endometritis

2.2 病原菌的分子生物学鉴定

分子生物学鉴定结果显示，应用Bacteria F2和Bacteria R2引物对能成功扩增所有菌株的16SrDNA序列，各菌株的16SrDNA序列片段长度约为1.4kb～1.5kb（图1）。

图1 部分菌株的16SrDNA PCR扩增结果Fig.1 PCR results of 16SrDNA for some pathogenic bacteria from cows with endometritis

16SrDNA的序列比对和遗传发育分析结果表明，01、05、06、08号大肠埃希菌菌株与埃希属同源性最高（99%～100%），亲缘关系最近（图2A），均为大肠埃希菌。03、17、21、23号葡萄球菌菌株均与金黄色葡萄球菌的同源性最高99%～100%，在遗传进化树中与金色葡萄球菌同处于一个分支，确定该4株葡萄球菌均为金黄色葡萄球菌（图2B）。19、47号沙门菌菌株与肠道沙门菌的同源性最高（99%），亲缘关系最近（图2A），均为肠道沙门菌。15、34号链球菌菌株与无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌的同源性高达99%～100%，15号菌株与无乳链球菌处于相同的进化树分支上，而34号菌株与停乳链球菌处于相同的进化树分支上（图2C），确定该2株菌分别为无乳链球菌和停乳链球菌。分离的7株链球菌，6株与15号菌株形态和生化反应一致为无乳链球菌，1株与34号菌株形态和生化反应一致为停乳链球菌。41号棒状杆菌与数据库中的化脓棒状杆菌同源性最高（100%），亲缘关系最近（图2D），确定该菌株为化脓棒状杆菌。

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果表明，大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢噻肟等头孢类抗生素较敏感，其耐药率均小于20%；对氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、强力霉素、四环素、复方新诺明、链霉素、卡拉霉素均有不同程度的耐药，其中对氨苄西林和四环素耐药率较高，耐药率均大于80%，对环丙沙星、氧氟沙星、复方新诺明、链霉素、卡拉霉素耐药率大于50%。葡萄球菌对万古霉素、头孢西丁、头孢噻肟、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等药物较敏感，其耐药率小于20%。对红霉素、麦迪霉素、青霉素G、氨苄西林、头孢唑啉、强力霉素、四环素、复方新诺明均出现不同程度的耐药，其中对青霉素G、氨苄西林、四环素、复方新诺明耐药率较高，均大于50%（表2）。

3 讨论

李宏胜等［11］报道，引起兰州地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌为化脓隐秘杆菌、大肠埃希菌、屎肠球菌、无乳链球菌，以单一感染为主。胡文举等［12］报道，引起河南平顶山奶牛子宫内膜炎的主要病原菌为蜡样芽胞杆菌、大肠埃希菌、奥斯陆莫拉菌等，以单一感染为主。李润元等［13］报道，引起锡林浩特市周边地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌为葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、化脓棒状杆菌、变形杆菌等，以混合感染为主。张银亮等［14］报道，引起新疆北部地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、蜡样芽胞杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌。本研究从宁夏吴忠市、银川市规模化牛场78头患子宫内膜炎奶牛子宫冲洗液中，分离出65株大肠埃希菌（55.56%）、42株金色葡萄球菌（35.9%）、6株无乳链球菌、1株停乳链球菌、2株肠道沙门菌、1株化脓棒状杆菌。引起宁夏地区规模化牛场奶牛子宫内膜炎的主要病原菌为大肠埃希菌和金色葡萄球菌，混合感染的比例较高（52.56%），单一感染（42.31%）以大肠埃希菌为主，葡萄球菌和分离的其他细菌主要为混合感染。本次试验分离到的病原菌种类和比例与上述报道存在部分差异，引起这些差异的原因可能与各地卫生状况、采样时间、病原菌分离鉴定方法以及鉴定者的经验等方面有关。本研究分离的细菌多为广泛存在于环境中及畜体内的常见菌，其中有些是条件性致病菌。可见引起宁夏地区奶牛子宫内膜炎主要原因是奶牛产后体质虚弱、免疫力下降，环境中及畜体内病原微生物乘机侵入而致。因此，牛场应加强奶牛产后饲养管理，增强奶牛产后免疫力，定期对环境进行消毒，减少致病菌的传播。

图2 奶牛子宫内膜炎病原菌的遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of pathogenic bacteria in dairy cows with endometritis

表2 42株金色葡萄球菌和65株大肠埃希菌对常用抗菌药物的敏感性试验结果Table 2 Drug sensitivity test results of 42 S.aureus strains and 65 E.coli strains to commonly used antimicrobial drugs %

不同地域、不同牛场，甚至同一牛场不同季节引起奶牛子宫内膜炎的病原菌均不相同。因此，病原菌快速准确的鉴定，以及敏感药物的筛选，可有效避免抗菌药物的滥用，降低细菌耐药性的产生。奶牛子宫内膜炎病原菌鉴定方法主要以生化鉴定为主，近年来，随着分子生物学技术的发展，16SrDNA序列分析逐渐用于该领域病原菌的鉴定研究。张洪波等［15］、王孝武等［16］用16SrDNA 序列分析法对奶牛子宫内膜炎病原菌进行鉴定，鉴定的病原菌种类与报道的基本一致。本研究中作者发现，由于作者经验不足，试验过程中假阳性的出现，以及同属不同种的细菌生化反应结果可能并不完全一致，仅通过形态和生化反应很难准确判断。本研究先通过形态学和生化鉴定对病原菌进行初步鉴定归类，再选取形态和生化反应有差异的同一属细菌采用16SrDNA序列分析方法对其进一步鉴定，同时确定其进化地位，为进一步研究其遗传背景、菌株间亲缘关系和致病机制提供理论依据。研究结果显示，选取的4株大肠埃希菌均为大肠埃希菌，4株葡萄球菌均为金色葡萄球菌，2株链球菌分别为无乳链球菌和停乳链球菌，2株沙门菌均为肠道沙门菌，1株棒状杆菌为化脓棒状杆菌。

药敏试验结果显示，大肠埃希菌对头孢唑啉、头孢西丁、头孢噻肟等头孢类抗生素较敏感，对氨苄西林耐药率均较高，可能与牛场频繁使用这种药物，导致超抗基因的产生有关［17］。万古霉素、头孢西丁、头孢噻肟、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星对金色葡萄球菌抑菌效果较好，敏感率大于80%，与王桂琴等［6］报道的宁夏奶牛子宫内膜炎金色葡萄球菌对万古霉素、氟喹诺酮类和头孢类抗生素敏感率在60%以上基本一致。本研究中金色葡萄球菌对四环素的敏感率小于30%，与王桂琴等报道大于60%不一致，可能与分离的季节和牛场不同等因素有关。本次分离的病原菌中链球菌、肠道沙门菌、化脓棒状杆菌所占比例较小，故没做药敏试验。研究发现，从宁夏银川市和吴忠市规模化牛场分离出的奶牛子宫内膜炎主要病原菌及其对抗菌药物的耐药情况无显著差异，可能与银川和吴忠市距离较近，牛场之间常有交流，用药情况大致相似有关。

综上所述，本研究中6个规模化牛场奶牛子宫内膜炎致病菌主要为大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌，且以混合感染为主。大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌对青霉素G、氨苄西林、四环素、复方新诺明、链霉素、卡拉霉素的耐药性较强，对万古霉素、头孢西丁、头孢噻肟较敏感。

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