一起牦牛巴氏杆菌病的诊断

王继练，张焕容，郝一妹

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

牦牛巴氏杆菌病（Pasteurellosis）是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）引起的牛的一种急性败血性传染病，又称牛出血性败血症。以肺炎、急性胃肠炎及内脏器官广泛出血等为主要特征［1］，临床表现为高度呼吸困难和体温升高、气喘、鼻腔流出浆液性泡沫样渗出物［2］，慢性经过表现为皮下组织、关节、各脏器的局限性化脓性炎症，急性胃肠炎［3-4］。该病多呈散发性或地方流行［5］，主要发生在牦牛饲养集中的高寒缺氧地区，一年四季均可发生，但秋冬季节发病较多［6］。中国是牦牛的主产国，据统计我国牦牛数量占世界牦牛总数1 400万头的92%，分布于青海有470万头，西藏415万头，四川397.1万头，甘肃112万头，新疆25万头，云南5万头左右。我国近年来常有牦牛巴氏杆菌病的相关报道。1990年-2005年青海省有34个县（市）报道牦牛发生牛巴氏杆菌病的发生，占全省行政区划县数的77.3%，发生疫情467起，发病牛29 032头，死亡牛9 453头［7］。2004年-2008年5年间，牦牛巴氏杆菌病在青海省天峻县6个乡镇均有发生，占全县行政规划乡镇数的60%，共发生疫情10起，疫点共10个，发病率5.9%（87／1 466），平均致死率为57.47%（50／87）［8］。2010年-2012年，调查组在甘肃南部牧区设定了8个调查点，共计对8 100余头牦牛进行了巴氏杆菌发病流行病学情况调查，牦牛巴氏杆菌病在甘南牧区平均发病率达6.87%，病死率达28.7%［9］。巴氏杆菌病给牦牛养殖业造成了严重的经济损失［10］。

本文对2014年11月初四川甘孜州某牦牛养殖场发病牦牛进行临床诊断、病理剖检变化、细菌的分离纯化和染色镜检，PCR鉴定及致病性试验，最终确诊该牦牛养殖场发生的疫病为多杀性巴氏杆菌引起的牦牛巴氏杆菌病，为该病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基和营养肉汤培养基为杭州微生物公司产品；胎牛血清为GIBCO公司产品；10×buffer、Mg2＋、dNTP、ExTaqDNA 聚合酶为TaKaRa公司产品；DNA MarkerⅠ、DH5α大肠埃希菌为 Tiangen公司产品；E.Z.N.ATMGel Extraction Kit（D2501-01）和 E.Z.N.ATMPlasmid MiniKit（D6942-01）为美国Omega生物技术公司产品；pMD19-T序列载体试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.2 实验动物 18g～22g健康昆明小鼠10只，由成都中医药大学提供。

1.1.3 引物 参照文献［11］设计多杀性巴氏杆菌的上、下游引物Pm KmT1和Pm KmT2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

表1 多杀性巴氏杆菌检测引物Table 1 Primers for detection of Pasteurella multcida

1.2 方法

1.2.1 样品的采集 病料来自于四川省甘孜州某牦牛养殖场病死牦牛，无菌采取心、肝、脾、肺和淋巴结等样本。

1.2.2 临床症状及剖检病变 发病牦牛体温升高，食欲减退，精神委靡，呼吸困难，发病后期粪便中带有血液。剖检发病牦牛发现呈急性败血症变化，肺脏和脾脏肿大，内脏器官广泛出血，淋巴结肿大，肺泡内有大量带血泡沫，胸腔有渗出液。

1.2.3 细菌的分离培养及染色鉴定 无菌采取病死牦牛心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结等组织材料划线接种于含50mL／L胎牛血清的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上，将每个组织器官分离到的菌落分别接种到普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、血液琼脂平板和含50mL／L胎牛血清的TSA平板上，37℃培养24h～48h，观察各组织分离细菌的生长状况，并进行革兰染色镜检，无菌采取的组织触片后瑞氏染色并镜检观察。

1.2.4 动物致病性试验 将分离细菌培养菌液接种5只昆明小鼠，每只小鼠颈部皮下注射0.2mL菌液，注射后观察小鼠精神状态及发病死亡情况。同时对5只小鼠腹腔注射生理盐水（每只0.2mL）作为对照［12］。对死亡或濒死小鼠处死后无菌采取小鼠心血、肝、脾等组织，划线接种于含50mL／L胎牛血清的TSA培养基上培养24h～48h后革兰染色镜检观察，同时对心血涂片、肝和脾组织触片进行瑞氏染色观察。

1.2.5 分离细菌的PCR鉴定 以各组织器官分离纯化的菌落作为模板，通过PCR扩增目的片段。PCR反应体系25μL：10×PCR buffer 2.5μL，4×dNTPs（10mmol／L）2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，TaqDNA聚合酶（5U／μL）0.2μL，模板2μL，无菌水 18.3μL。PCR 反应条件：94 ℃5min；94℃30s，60℃35s，72℃40s，共30个循环；72℃8min。PCR扩增所得产物用20g／L琼脂糖凝胶进行电泳检测，通过凝胶成像系统观察并记录结果。

1.2.6 PCR扩增产物的克隆和测序 采用E.Z.N.ATMGel Extraction Kit（D2501-01）回收PCR产物。按说明书的操作步骤，将回收的PCR产物与pMD19-T载体进行连接。连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，预培养1.5h后，将预培养液涂布于含有100μg／mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养24h后挑取阳性菌落接种至含有100μg／mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜的菌液，送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

2 结果

2.1 流行病学调查、临床症状及剖检病变

发病牦牛体温升高，采食量下降，精神沉郁，呼吸严重困难，发病后期粪便带血。剖检死亡牦牛见急性败血性变化，肺脏和脾脏肿大，内脏器官广泛出血，淋巴结肿大，肺泡内有大量血性泡沫，胸腔有渗出液。根据临床症状与牦牛巴氏杆菌病的临床特征相符，初步怀疑该病是由多杀性巴氏杆菌引起的牦牛巴氏杆菌病。

2.2 细菌分离培养

病死牦牛心、肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结等组织划线接种培养，最后分离得到多株菌落形态相同的细菌，根据巴氏杆菌在不同培养基上的生长状况不同，选择普通培养基、麦康凯培养基、血琼脂培养基、血清TSA培养基对其进行鉴定。结果在普通培养基上生长贫瘠，麦康凯培养基上不生长，血清TSA培养基和血琼脂培养基上生长良好，菌落灰白色、圆形、湿润、呈闪光露珠样菌落，血琼脂培养未见溶血现象。

单菌落革兰染色镜检见革兰阴性短小杆菌，瑞氏染色呈两极着色的杆菌（图1、图2），符合巴氏杆菌的染色特性。

图1 革兰染色Fig.1 Gram staining

图2 瑞氏染色Fig.2 Wright’s staining

2.3 致病性试验结果

试验组小鼠于注射细菌后24h内全部死亡。剖检可见心包和胸腔有浆液性、纤维素性渗出物，肠道出血明显，肝脏表面有针尖大的灰白色坏死灶。剖检死亡小鼠，心血涂片、肝和脾组织触片瑞氏染色镜检，可见两极浓染的小杆菌。

2.4 PCR鉴定结果

以分离菌作为模板，经PCR扩增，获得460bp的特异性条带（图3），与预期片段大小一致。

图3 PCR产物电泳扩增图Fig.3 Electrophoresis of PCR products of target gene

分离菌PCR产物克隆测序结果见图4。在NCBI上对测序结果进行比对分析，结果显示所获得的序列与已公布的多杀性巴氏杆菌的KMT1基因部分序列的同源性均大于97%。结果表明分离到的菌株为多杀性巴氏杆菌。

图4 NCBI比对结果Fig.4 NCBI comparison results

3 讨论

本试验根据发病牦牛的临床症状和病理剖检病变、细菌分离培养特征和染色鉴定结果，以及分离菌对小鼠致病性和多杀性巴氏杆菌PCR检测结果，确诊该致病菌为多杀性巴氏杆菌。该牦牛养殖场暴发的疾病为牦牛巴氏杆菌病。

多杀性巴氏杆菌为条件性致病菌，一般存在于健康动物的呼吸道，当家畜在外界诱因诸如气温骤变、畜体营养不良、过度疲劳、拥挤、闷热、长途运输等环境应激作用下，均可使机体抵抗力下降而发病［13］。该牦牛场发病时正是刚从夏季牧场转运至冬季牧场，且由于冬季牧场旁噪声巨大的矿石加工厂，牦牛转运和环境条件的应激与该病的条件诱发性发生相符。因此，建议饲养过程中应减少导致该病发生的多种应激因素［14］，平时应加强饲养管理，提高饲养营养水平，增强牦牛体质，做好平时的预防消毒工作，牧区放牧牦牛应注意避开过渡阴湿草场放牧［15］。

对于发病区域应严格进行场地的消毒，具体方法可将患畜排泻物堆积后用生石灰消毒，用200mL／L的来苏儿对被污染过的草场、圈舍、用具进行彻底消毒，尸体深埋。通过药敏试验筛选出敏感药物对病牛进行治疗，避免药物的滥用［16］。对于健康牦牛，需做好预防工作，在牦牛养殖过程中，实时对牦牛的饮食状况和健康状况进行观察，发现病情及时采取隔离措施，对疫情发生地及周边地区的假定健康牛，采用牛巴氏杆菌灭活疫苗进行紧急免疫接种，通过科学的诊断方法进行确诊，及时治疗，争取把疫病造成的损失降低到最低限度。

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