禽多杀性巴氏杆菌不同培养方法制备的种子液对高密度发酵培养菌数的影响

吴信明，王 艳，孙翠平，孟海滨，程立坤，韩文瑜，沈志强＊

（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600；2.吉林大学动物医学学院，吉林长春130062；3.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州256600）

禽多杀性巴氏杆菌是引发禽霍乱的病原体，该病是一种侵害养禽业的高度接触性传染病，发病率和病死率都很高，给养禽业带来巨大损失［1-2］。控制禽霍乱的主要措施以疫苗接种为主，使用的疫苗主要有禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗、蜂胶灭活疫苗、油乳剂灭活疫苗和禽多杀性巴氏杆菌活疫苗等［3-4］。我国《兽用生物制品制造与检验规程（2000版）》中规定的培养工艺主要是扁瓶固体培养法和液体发酵培养法［5-6］。其中，液体发酵培养因生产效率高、成本低等优势被广泛采用。为了比较不同培养方法制备的种子液对禽多杀性巴氏杆菌大规模发酵培养抗原浓度的影响，寻求科学、经济的种子液制备方法，本研究在培养基营养成分和温度、pH、溶氧等培养条件相同的情况下，对用不同方法制备的生产种子液的高密度发酵培养结果进行了对比试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 禽多杀性巴氏杆菌C48-1株，由中国兽医药品监察所提供，山东绿都生物科技有限公司传代保存。

1.1.2 培养基 牛肉浸粉，马丁干粉，琼脂粉，蛋白胨等为青岛海博生物技术有限公司产品；改良马丁肉汤由山东绿都生物科技有限公司自制。

1.2 方法

1.2.1 菌种的复活与选择

1.2.1.1 菌种的复活 将保存的菌种在马丁固体培养基上进行复壮、纯化后，接种到扁瓶中培养［3］。1.2.1.2 菌种的选择 复壮后的菌种经过形态、培养特性、菌型、抗原性和免疫原性鉴定，合格菌种准许用于制苗；将经鉴定符合标准的菌种接种于马丁琼脂固体培养基上进行增殖培养，经纯粹检查、活菌计数达到标准后即为种子液，用于菌苗生产；种子液通常保存于2℃～8℃，不得超过规程规定的使用期限［5］。

1.2.2 生产种子制备

1.2.2.1 一级生产种子制备 将冻干菌种接种于含0.1%裂解血球全血马丁肉汤中，置36℃～37℃培养24h，然后划线接种于含0.1%裂解血球全血的马丁琼脂平板上，选取5个以上典型菌落，接种鲜血琼脂斜面若干支，置36℃～37℃培养18h，作为一级种子。在2℃～8℃保存，使用期不超过14d；在培养基上传代，不超过5代［5］。

1.2.2.2 二级生产种子制备

1.2.2.2.1 扁瓶固体培养（试验组Ⅰ） 取一级种子接种于含0.1%裂解血球全血的改良马丁琼脂培养基的扁瓶中，置37℃温室内培养18h，镜检后收获，即为二级种子，4℃保存备用。

1.2.2.2.2 摇床液体培养（试验组Ⅱ） 取一级种子接种于含0.1%裂解血球全血的改良马丁肉汤培养基的三角锥瓶中，于37℃条件下摇床培养12h，镜检后收获，作为二级种子，4℃保存备用。

1.2.2.2.3 发酵罐培养（试验组 Ⅲ） 取一级种子接种于含0.1%裂解血球全血的改良马丁肉汤培养基的10L发酵罐中，参考相关文献报道［7-9］，确定发酵培养条件为：温度为37 ℃，pH 7.2，溶氧为100%，罐压0.05MPa，转速为100r／min，加入培养基量0.1%的消泡剂，培养8h，收获菌液作为二级种子，4℃保存备用。

1.2.2.3 活菌计数 取上述3种二级生产种子培养液分别做活菌计数。活菌计数采用表面培养测定法，参照文献进行［10］。

1.2.3 高密度发酵生产 使用三联发酵罐（200L，培养基量为150L）进行发酵生产，种子液加入量为2%。根据二级生产种子液活菌计数结果，用马丁肉汤稀释调整至3 000mL，分别加入发酵罐中，使接入总菌数保持一致，按操作规程进行发酵生产。接种2h后每1h取样镜检1次，观察细菌生长状况，并在培养8h后，收获培养液，同时取样进行比浊计数和活菌计数。比浊计数采用麦氏比浊管进行［9］。重复进行3次试验。

1.2.4 数据统计与分析 试验数据在 Windows XP系统下应用SPSS 19.0进行统计与分析，采用LSD多重比较进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 二级生产种子培养液活菌计数

在二级生产种子液制备方面，扁瓶固体培养的浓度最高，最高可达3.52×1010CFU／mL，平均值为3.37×1010CFU／mL，极显著高于（P＜0.01）发酵罐培养和摇床培养（表1）；发酵罐培养次之，但远低于扁瓶固体培养活菌浓度；摇床液体培养的最低，其活菌浓度仅为扁瓶培养31.2%。

2.2 高密度发酵生产增菌

使用麦氏比浊管，对高密度发酵培养后菌液进行比浊计数（表2）。扁瓶固体培养法3批次平均值为2.38×1010CFU／mL，略高于摇床液体培养法（2.32×1010CFU／mL），以发酵罐培养增菌效果最佳，为2.68×1010CFU／mL。可见，不同培养方法增菌效果有一定差异，但未达到显著性水平（P＞0.05）。

表1 二级生产种子液活菌计数结果Table 1 The viable bacterial count results of second stage seed production CFU／mL

表2 高密度发酵生产增菌结果（比浊计数）Table 2 The bacterial results of high-density fermentation（Turbidimetric count） CFU／mL

采用表面培养测定法，对高密度发酵培养后菌液进行活菌计数。其中，发酵罐培养活菌计数平均值达1.97×1010CFU／mL，极显著高于其他两种培养方法（P＜0.01）。扁瓶固体培养法与摇床液体培养法增菌效果相当，3批次平均值分为1.62×1010CFU／mL和1.63×1010CFU／mL，均极显著低于（P＜0.01）发酵罐培养法（表3）。

表3 高密度发酵生产增菌结果（活菌计数）Table 3 The bacterial results of high-density fermentation（Viable count） CFU／mL

3 讨论

10L发酵罐培养制备的禽多杀性巴氏杆菌种子接种200L发酵罐进行高密度发酵培养后测得的活菌数可达1.85×1010～2.05×1010CFU／mL，比浊计数为2.45×1010～2.80×1010CFU／mL；扁瓶固体培养法制备的种子液经高密度发酵培养后测得的活菌数为1.56×1010～1.65×1010CFU／mL，比浊计数为2.10×1010～2.59×1010CFU／mL；而摇床液体培养法制备的种子液经高密度发酵培养后测得的活菌数为1.54×1010～1.74×1010CFU／mL，比浊计数为2.10×1010～2.45×1010CFU／mL。说明10L发酵罐培养制备的种子液优于扁瓶固体培养法和摇床液体培养法制备的种子液，而后两者无明显差别；从3批次平均值看，前者比后两者活菌计数结果提高约21.60%，比浊计数结果提高约15.52%，比浊计数结果与活菌计数结果呈正相关性。所以采用10L发酵罐培养制备的禽多杀性巴氏杆菌种子进行高密度发酵培养可显著提高菌液浓度，增加单位抗原含量。

细菌在发酵培养时，易受环境影响，在发酵罐中培养，温度、溶氧量和pH等生长条件均易控制，生长环境比较稳定，所以菌体生长状况较好［8］。扁瓶固体培养制备的种子液中细菌已经适应了扁瓶的生长条件，当加入发酵罐以后，生长用的培养基由固体转为液体，细菌需要一定的适应时间，这段时间称为适应期［9］；摇床液体培养时，溶氧量和pH等生长条件不受控制［10-11］，细菌生长靠自身调节，活性受影响，当加入发酵罐以后，细菌也需要一定的适应时间恢复其活性［12］。而使用小发酵罐培养制备的种子液接种至大发酵罐之后，培养基仍为液体，细菌同样需要一定的适应时间，但它的适应期比前两者要短，所以比前两者更快地进入对数生长期，菌液浓度较高。其他原因如细菌活力、菌龄等尚有待进一步探讨。

在实际生产中，扁瓶固体培养法制备种子有利于收集到高浓度的菌液，但存在着生产成本高、费工费力、机械化和自动化程度低等缺点，很少采用；摇床液体培养法制备种子具有操作简单，污染易于控制等优点，但其细菌生产缓慢，菌液浓度较低［13］；采用小型发酵罐制备生产种子具有生产效率高、菌液浓度大等优点而被广泛使用［14］，但同时也存在对操作人员要求较高，污染风险大等缺点。因此，在实际生产中可根据具体情况进行选择。

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