响应面法优化榆耳多糖提取工艺的研究

常桂英（1.吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101；2.吉林省高校“长白山动植物资源利用与保护”重点实验室，吉林吉林132101）

响应面法优化榆耳多糖提取工艺的研究

常桂英1，2
（1.吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林132101；2.吉林省高校“长白山动植物资源利用与保护”重点实验室，吉林吉林132101）

摘要：应用水提法对榆耳子实体中的多糖进行提取条件优化，以提高多糖提取率。依据单因素和Box-Behnken的试验设计，用响应面分析方法对水提法提取榆耳多糖的工艺进行优化研究。研究以榆耳多糖提取率为响应值，提取温度、提取时间、料液比和提取次数为试验因素。结果表明：水提法的最优提取工艺参数为提取温度84.925℃、提取时间3.477 h、料液比1∶50（g/mL）、提取次数为4次。在最优提取工艺参数下多糖的实际提取率为9.596%。其中影响榆耳多糖提取率的主次因素为：提取时间（B）＞提取温度（A）＞料液比（C）＞提取次数（D）。

关键词：榆耳；多糖；响应面

榆耳（Gloeostereum incarnatum Imai），又称榆蘑，是分布于我国东北部山区、日本北海及前苏联西伯利亚地区的一种稀有药食兼用野生真菌[1]，具有提高免疫力，强身健体，抗氧化，止痢抑菌[2]的功效。榆耳多糖是榆耳子实体中的主要生物活性物质，目前对其研究主要集中在多糖结构和药理作用方面[3]，如高炬等应用层析分离的方法从榆耳发酵液中分离出新倍半萜榆耳三醇；王述声等对榆耳多糖水溶性多糖GIA进行结构分析，发现其主要糖苷键为α型，有少量的β糖苷键，Gal和Glc为其主体结构，但刘瑞君的研究却表明榆耳多糖是以β糖苷键连接的；刘丹发现榆耳浸膏中有明显抗菌作用的是醇溶小分子[4]。此外，榆耳多糖能够抑制人体部分肿瘤细胞的生长，为其功效的研究提供了新的方向。

近几年，我国东北、山东地区出现了人工栽培的榆耳，色泽好，品质佳，其中吉林省为榆耳栽培的主要产区，占全国榆耳总产的70%～80%[5]，为大规模生产榆耳多糖提供了保障。但是，目前针对榆耳多糖提取工艺方面的研究甚少，限制了榆耳多糖工业化生产。响应面法优化菌类多糖的提取工艺被研究者广泛关注，本研究将采用响应面法对榆耳多糖的最佳提取工艺进行研究，分析各试验因素及其间交互作用对榆耳多糖提取率的影响，并通过对拟合多元二次回归方程分析获取最佳工艺参数。以期为工业化生产的榆耳多糖在医药开发应用方面提供工艺支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

榆耳子实体由吉林农业科技学院食用菌研究中心提供；乙醇、苯酚、硫酸等均天为天津基准化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。

1.2设备

FA1004A电子天平：上海精天电子仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；KDC-1044低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；RE-5299旋转蒸发仪：青浦沪西仪器厂；FW-177中草药万能粉碎机：上海华岩仪器设备；UV-759-CRT：上海科估科学仪器有限公司；DHR-924385-III：上海科苗医疗器械制造有限公司。

1.3方法

1.3.1标准曲线的绘制

以葡萄糖为标准品，配制成浓度为0.2mg/mL的葡萄糖标准溶液。吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL葡萄糖标准溶液，分别置于具塞试管中，加蒸馏水至2.0m L，再加入1.0m L质量分数为6%苯酚，摇匀后，添加5.0mL浓硫酸，摇匀后，室温（25℃）放置20min后，以蒸馏水管为空白，在490 nm下测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线形回归，获得葡萄糖溶液浓度（C）与吸光度值（A）关系曲线的回归方程式：C=0.135A-0.046 6，R2=0.997 9标准曲线具有良好的拟合性。

1.3.2榆耳多糖含量测定

榆耳子实体的预处理：将采后的榆耳子实体除杂、清洗后，在40℃低温烘箱中烘至恒重。用中药粉碎机将烘干子实体粉碎，过40目筛，然后用索氏提取器对其脱脂，干燥后备用。

榆耳多糖的提取：称5.00 g榆耳粉末，用不同提取温度、提取时间、料液比和提取次数对榆耳多糖进行提取和离心。将离心后的上清液进行减压浓缩。按体积比1∶4将浓缩液加入到无水乙醇中进行醇析，离心、烘干得到榆耳粗多糖。

1.3.3单因素试验及响应面

根据榆耳多糖提取方法，取5.00 g榆耳粉末浸于中性蒸馏水中，考察试验中提取温度（50、60、70、80、90℃），浸提时间（1、2、3、4、5 h），料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL）和浸提次数（1、2、3、4、5次）对榆耳子实体多糖提取率的影响，并对多糖提取率进行计算，每组试验重复3次。

在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken试验设计，以榆耳多糖提取率（Y）为响应值，提取温度（A），提取时间（B），料液比（C）和提取次数（D）为试验因素，利用响应面法在四因素三水平上对榆耳多糖提取工艺进行优化研究。采用Design Expert Version 9.0软件对数据进行分析。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1提取温度对榆耳多糖提取率的影响

提取温度对榆耳多糖提取率的影响见图1。

图1　提取温度对榆耳多糖提取率的影响Fig.1　Effectofextraction tem perature on extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

由图1可知，随着提取温度的升高，榆耳多糖提取率逐渐增加；当温度超过80℃，榆耳多糖提取率反而下降。结果表明，浸提液温度升高能增加榆耳多糖在水溶液中的溶解度，温度在80℃左右达到最高提取率，但是温度过高可能导致榆耳多糖的结构被破坏，而且当温度高于80℃时可能会导致多糖的生物活性降低。

2.1.2提取时间对榆耳多糖提取率的影响

提取时间对榆耳多糖提取率的影响见图2。

由图2可知，随着提取时间的增加，榆耳多糖提取率逐渐增加；但提取时间达到3 h后，榆耳多糖的提取率开始下降。榆耳多糖随着浸提时间的延长，其在水溶液中的溶解度会增加，浸提3 h达到饱和状态，随着时间的延长，持续的高温可能会破坏多糖结构，从而降低了多糖的溶解。另外，浸提时间越长，提取所耗能就越大，从而增加经济成本，因此榆耳多糖的浸提时间以3 h为宜。

2.1.3料液比对榆耳多糖提取率的影响

料液比对榆耳多糖提取率的影响见图3。

图2　提取时间对榆耳多糖提取率的影响Fig.2　Effectofextraction timeon extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

图3　提取液料液比对榆耳多糖提取率的影响Fig.3　Effectofsolid to liquid ratio on extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

由图3可知，随着料液比的增加，榆耳多糖提取率逐渐增加；当料液比达到1∶40（g/mL）后，提高水溶液的比例会使榆耳多糖提取率下降，这可能是因为榆耳的比例变小使得其在溶解过程中速度缓慢。另外，如果试验过程中的料液比比例过大也增加了后期浓缩的难度，增加浓缩时间，所以料液比控制在1∶40（g/mL）左右为好。

2.1.4提取次数对榆耳多糖提取率的影响

图4　提取次数对榆耳多糖提取率的影响Fig.4　Effectofextraction cycleson extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

由图4可以看出，随着提取次数的增加，榆耳多糖提取率逐渐增加；但提取3次后，榆耳多糖提取率增加缓慢并趋于平稳，表明榆耳多糖已经基本被提取完全。另外，随着提取次数的增多所消耗的溶液体积增大，所需的能耗也有较大的提高，所以提取次数控制在3次为佳。

2.2响应面法优化榆耳多糖提取工艺

在单因素试验结果的基础上，采用Box-Benhnken试验设计，以提取温度（A），提取时间（B），提取液中料液比（C）和提取次数（D）为试验的4个因素，并用Y代表多糖的提取率，设计四因素三水平的试验方案。因素水平及编码见表1，试验设计方案及结果见表2。

表1　榆耳多糖提取率响应面设计因素与水平Table1　Coded valuewith its relationalactualvalueof design

表2　榆耳多糖提取率的响应面试验方案及结果Table2　Box-Benhnken designmatrix and corresponding results ofexperiment

采用Design-Expert v9.0软件对榆耳多糖提取率进行多元模型拟合分析，得到榆耳多糖提取率Y与榆耳多糖提取温度、提取时间、提取液的料液比和提取次数的多项二次回归方程：

应用软件Design-Expert9.0对试验结果进行方差分析，见表3。

表3　二次相应面模型方差分析Table3　ANOVA for responsesurface quadraticmodle

由表3的结果可以得出以下结论：该响应面模型的F值为10.07，P＜0.000 1回归性显著，该模型的失拟项的F值为0.47，P=0.831 4＞0.05，表明该模型拟合性良好，由不确定因素所带来的影响可以忽略。此模型的样本决定系数R2=0.921 6；模型的样本调整决定系数为AdjR2=0.830 0；该模型中的预测样本决定系数为Pred R2=0.630 6。预测样本决定系数与调整后的决定系数较一致，故该模型拟合度较好，用此模型可用于对水法提取榆耳多糖提取率的分析和预测。

由表3可知，该模型中一次项中B对该模型的影响达到显著（P＜0.05）水平。二次项中B2和C2和D2对该模型的影响均达到极显著（P＜0.01）水平，A2则达到了显著（P＜0.05）水平，此外，该模型的交互项中AB、 AD、BD和CD均达到了极显著（P＜0.01）水平，AC和BC达到了显著（P＜0.05）水平。由此可知，试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，且影响根据多榆耳多糖提取率的因素的顺序为：提取时间（B）＞提取温度（A）＞料液比（C）＞提取次数（D）。

2.3交互项作用对榆耳多糖提取率影响的分析

通过Design-expert软件，多项二次回归方程可得到响应面图，见图5。

图5　各因素交互作用对榆耳多糖提取率的响应面图Fig.5　3-Dm od legraphs for theeffects of interaction on the extraction ratio of polysaccharide from G.incarnatum

响应面图可以反映试验中交互项的相互作用。模型中交互项AB、AD、BD和CD对模型的影响达到了极显著（P＜0.01）水平（对应为图A、C、D、E），AC和BC达到了显著（P＜0.05）水平（对应为图B、F），由图可知，A-F图具有类似的变化趋势，在低编码水平时榆耳多糖提取率均随编码值的变化先升高后降低，根据响应面和等高线，在试验各条件所选取的范围内，存在极值点，在响应面图中表现为最高值点，在等高图中表现为椭圆中心点。

由A图知，在提取温度相对较低的情况下提取时间延长会增加多糖分解的风险。而提取时间固定，提高提取温度可以在一定程度上增加多糖的提取率，延长时间可以使多糖尽可能的浸出，以增加多糖的得率。由图B知，在温度编码水平一致的情况下，料液比的低水平到高水平的多糖提取率变化不显著，在高水平时变化平缓。由图C知，提取次数的增加在一定程度上增加了提取的时间，降低提取效率，增加了能耗，在持续的提取过程中多糖结构会发生降解。由图D知，提取时间在低编码水平时，随提取次数的增加提取率降低，而提取时间在高编码水平时恰好相反。因此短时间提取不能充分溶解多糖；多次提取多糖却加大了后期浓缩的难度。由图E知，提取次数与料液比在较低编码水平向较高编码水平变化时提取率均是先逐渐升高后趋于稳定。在该二因素都趋于高编码水平范围内时，多糖的提取率较高。若继续增加提取次数或料液比则可能会使多糖的结构降解导致提取率降低。由图F知，该图表现出的趋势与E相似，当提取时间与料液比都在低编码水平时，多糖提取率低，随着该二因素的增加，多糖溶解率增加，达到一定程度后趋于平衡，并因可能增加多糖分解的几率以导致其下降。

分析可知，榆耳多糖的最优得率为9.596%，而获得该提取率时的条件如下：提取温度84.925℃，提取时间3.477h，提取料液比1∶49.32（g/mL），提取次数3.821次（选取4次）。而预测最佳榆耳多糖的率为（9.753± 0.209）%，与最优得率的差值小于0.4%，能够很好的预测水法提取榆耳多糖的得率。

3　结论

依据单因素试验和响应面试验结果可知，水提法中各因素优化后可以显著的提高榆耳多糖的提取率。响应面法可以较全面的评估、优化榆耳多糖的提取工艺，在节约能量，材料和缩短时间的前提下，本研究获得的水法提取榆耳多糖的最佳工艺条件为：提取温度85℃、提取时间3.5 h、料液比1∶50（g/mL）、提取次数4次，此时多糖提取率为9.596%。经Box-Behnen Design的回归拟合分析，得到榆耳多糖提取率与提取温度（A），提取时间（B），料液比（C）和提取次数（D）的二次多项式回归方程Y=8.68-0.064A+0.170B+ 0.035C+0.032 D-0.550 AB+0.250AC-0.340AD+ 0.310BC+0.450BD-0.460CD-0.240A2-0.540 B2-0.310C2-0.360D2。

在榆耳大规模工业化生产的基础上，本研究为提取菌类多糖提供了新的材料来源，并且为榆耳多糖的开发及工业化生产提供了理论参数，具有比较广泛的发展前景。

参考文献：

[1]崔京春,郭海勇,刑效瑞,等.榆耳发酵液多糖对小鼠免疫力功能的影响[J].食品工业科技,2013(16):342-350

[2]王应男,张公亮,刘洋,等.榆耳菌丝体多糖的体外抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2012(12):194-196

[3]张公亮,祝明思,穆娜,等.榆耳液态发酵培养的优化及多糖的抑菌活性[J].中国酿造,2012(31):99-103

[4]李典忠.榆耳（Gloeostereum incarnatum）子实体及发酵液化学成分和药理成分活性研究[D].长春：吉林农业大学,2002

[5]柳洪芳,王新宇,吕金超,等.榆耳多糖的分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性研究[J]．中国生化药物杂志,2010,31(5):293

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.005

收稿日期：2015-05-19

基金项目：2013年吉林农业科技学院《微生物学》重点学科“榆耳多糖提取工艺优化研究”（2013－007）

作者简介：常桂英（1965—），女（汉），教授，硕士，研究方向：生物化学。

Optim ization of the Extraction Process of Polysaccharide from Gloeostereum incarnatum by Response Surface Methodology

CHANGGui-ying1，2
（1.Departmentof Bioengineering，Collegeof Jilin Agriculture Science and Technology，Jilin 132101，Jilin，China；2.Key Laboratory of the Animaland PlantResourcesof ChangbaiMountain Conservation and Utilization，College of Jilin Province，Jilin 132101，Jilin，China）

Abstract：The objective of this research was to optimize the extraction conditions of Gloeostereum incarnatum by using water in order to enhance the extraction rate of polysaccharide.Based on single factor and Box-Behnken experiment design，response surfacemethodology was used to optimize the conditions of extraction technique of polysaccharide from Gloeostereum incarnatum.In order to improve the extraction ratio，extraction temperature，extraction time，solid to liquid ratio and extraction cycle were optimized by response surface methodology.The results showed that the optimal hydrolysis conditions of the polysaccharide ratio were as followed：extraction temperaturewas84.925℃；extraction timewas3.477 h；solid to liquid ratiowas1∶50（g/mL）and the extraction cyclewas 4.Under the optimal conditions the theoretical extraction ratio of polysaccharide was 9.596%.Among the series of conditions，the importance effects on extraction ratio were ranged as extraction time，extraction temperature，solid to liquid ratio and extraction cycles.

Keywords：Gloeostereum incarnatum；polysaccharide；responsesurfacemethodology