低pH条件下大豆蛋白7S和11S组分的表面特性

徐红华,董世荣,何雪飞

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

低pH条件下大豆蛋白7S和11S组分的表面特性

徐红华,董世荣,何雪飞

(东北农业大学食品学院,黑龙江哈尔滨 150030)

本文采用7S形成纤维聚合结构的制备条件,研究低pH条件下长时间热处理对大豆蛋白7S和11S(包括酸性亚基和碱性亚基)乳化性和起泡性的影响。结果发现,低pH条件下长时间热处理的聚合手段,可以显著(p<0.05)改善不同大豆蛋白组分的起泡性,但对乳化性没有明显的改善作用,甚至对乳化稳定性有降低作用,这种改善程度与是否形成纤维聚合结构无关。与pH7.0条件下的热处理手段相比,低pH条件下长时间热处理的聚合手段能够使大豆蛋白7S和11S表面疏水性显著增加,这种特殊的结构变化更有力于提高起泡性能。因此,在低pH条件下长时间热处理后,7S和11S具有较高的表面疏水性和较好的起泡性能。

大豆蛋白,起泡性,乳化性,表面疏水性,聚合

与其他植物蛋白相比,大豆蛋白拥有较突出的表面性质,表面性质的改善取决于大豆蛋白分子的组成、形状、电荷分布、表面疏水性、空间结构、分子的柔性和刚性以及与其他成分的作用或反应等[1],其中,热聚合是改善蛋白质表面性质非常重要的手段之一。Wang 等人[2]发现在pH2.0条件下85℃加热7S的三种亚基(α,α′和β)6～20 h可以形成纤维聚合物;Tang等人[3]发现在pH2.0条件下80 ℃长时间加热7S可以形成纤维聚合物;同时Tang等人[4]研究发现pH 2.0的7S在不同的静电屏蔽条件下80 ℃加热也可以形成纤维聚合物。这种独特的蛋白质聚合结构引起了人们的广泛关注。本文研究了在低pH(2.0)长时间热处理条件下形成纤维聚合结构的7S与不能形成纤维结构的11S(包括酸性亚基和碱性亚基)的乳化性和起泡性,比较了与常规pH(7.0)条件下对应表面性能的差异,分析了不同pH条件下蛋白质热聚合物表面结构特性的变化,以及这种结构差异与界面性质之间的关系,希望为改善大豆蛋白功能性质提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆 购自东北农业大学大豆研究中心;自制脱脂豆粉 利用组织捣碎机将大豆磨碎,过60目筛,按照国标G2906-82进行脱脂,样品自然干燥得到自制脱脂豆粉(蛋白质49.44%,灰分0.0891%),ANS荧光探针,Sigma公司。

DS-1高速组织捣碎机 上海精科实业有限公司;BME100L高剪切混合乳化机 启东市长江机电有限公司;KDN-102C半自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司;F-4500荧光分光光度计 日本日立。

1.2 实验方法

1.2.1 7S和11S的分离 依据Nagano[5]的方法对7S和11S球蛋白进行分离。取一定量的自制脱脂大豆粉与去离子水按照1∶15(w/v)的比例进行充分溶解后调解pH至8.0,然后在室温下充分搅拌2 h。将溶液离心(9000×g,30 min),取上清液后,用2 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl,将pH调解至6.4,冰浴过夜。然后将溶液离心(6500×g,20 min,4 ℃)得到的沉淀即为11S球蛋白(用去离子水清洗两遍),收集上清液将pH调至4.8,离心(6500×g,20 min,4 ℃),沉淀为7S球蛋白。将所得的7S和11S球蛋白沉淀溶于去离子水中,调节pH至7.0,充分搅拌直至充分溶解后用去离子水透析48 h。冷冻干燥,即制得7S和11S球蛋白。

1.2.2 酸性亚基和碱性亚基的分离 酸性(Acidic subunits)和碱性亚基(Basic subunits)的分离和制备依据Mo[6]等人的分离方法。将上述分离得到的11S大豆球蛋白用30 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)配成5 mg/mL的溶液,添加10 mmol/L的β-巯基乙醇,然后在90 ℃水浴30 min后冷却,离心(10000×g,20 min,4 ℃),收集上清液和沉淀。收集的沉淀用去离子清洗两遍,此沉淀即为碱性亚基。将上清液调节pH至5.0,然后再离心(6500×g,20 min,4 ℃),沉淀用去离子水清洗两遍,即为酸性亚基。

1.2.3 热聚合物的制备 参考Wang等人[2]关于7S纤维聚合物的制备方法,分别将一定量的7S、11S、酸性亚基和碱性亚基溶于去离子水中,将溶液pH调至2.0(2 mol/L HCl和0.1 mol/L HCl),对照样pH调至7.0,然后在15000 g离心20 min(20 ℃),取中间清液,根据凯氏定氮测定的中间清液蛋白质含量结果,用去离子水调整蛋白质浓度至10 mg/mL,然后将溶液的pH精确调至2.0(对照样调至7.0),95 ℃水浴加热20 h,每隔2 h取样立即冷却,后立即冷却,4 ℃冰箱保存过夜。

1.2.4 表面疏水性的测定 利用ANS荧光探针法可以测定大豆蛋白表面疏水性的方法,在此基础上进行一定的修饰[7]。pH7.0或pH2.0、浓度为10 mg/mL的7S、11S、酸性亚基和碱性亚基溶液,在95 ℃分别加热20 h,每隔2 h取样,作为样品。然后用0.01 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)分别将加热后的样品溶液稀释成蛋白浓度0.1、0.05、0.0025、0.00125 mg/mL等一系列样品,然后加入20 μL的ANS(8 mmol/L,溶于0.01 mol/L的磷酸缓冲液,pH7.0)荧光探针,混匀后在室温下避光15 min,激发波长390 nm,发射波长470 nm以及狭缝5 nm的条件下,在荧光分光光度计下比色测得的荧光强度对蛋白溶液浓度作图,选择线性关系良好的回归线的斜率作为蛋白质表面的疏水性指数。

1.2.5 起泡性的测定 参考Motoi[8]等人测定蛋白质溶液的起泡能力(FC)和泡沫稳定性(FS)的方法进行如下实验。pH7.0或pH2.0、浓度为10 mg/mL的7S、11S、酸性亚基和碱性亚基溶液,在95 ℃分别加热0 h和20 h,然后用0.01 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液稀释至1 mg/mL,室温下用组织捣碎机12000 r/min均质1 min,立即转移至500 mL的量筒中测定搅打后大豆蛋白质样品泡沫的体积,再测定放置30 min后泡沫的体积,通过泡沫体积和静止后稳定的泡沫体积的比来计算样品的起泡能力(FC)和泡沫稳定性(FS),具体计算方法如下:

起泡能力(%)=V0/Vi×100

泡沫稳定性(%)=Vt/V0×100

式中:V0-起泡0 min时的泡沫体积,Vt-起泡t min后的泡沫体积,Vi-起泡前最初液体的体积。

1.2.6 乳化性的测定 蛋白质溶液乳化性能的测量采用Pearc[9]等人的方法。pH7.0或pH2.0、浓度为10 mg/mL的7S、11S、酸性亚基和碱性亚基溶液,在95 ℃分别加热0 h和20 h,然后分别取3 mL加入1 mL的大豆油,混合液在20000 r/min均质2 min,乳化液静止0 min和10 min,然后立即从乳化液中取10 μL加入5 mL的1 mg/mL的SDS中,混匀,在500 nm处测定吸光值,以1 mg/mL的SDS为空白调零。乳化活性(EAI)和乳化稳定(ESI)计算公式如下[10]:

EAI(m2/g)=((2×2.303)/(C×(1-φ)×104))×A500×D

ESI(%)=100×At/A0

式中:2.303-乳化活性计算常数;A500-溶液在500 nm下的吸光值,可用平均值计算,C-蛋白质浓度(g/mL),D-稀释倍数,φ-大豆油占乳化液的体积分数(φ=0.25),At-乳化液静止时间为t min时的吸光值,A0-乳化液静止时间为0 min时的吸光值。

1.2.7 数据分析 实验数据采用excel和Statisix8.1软件对实验数据进行统计分析。数据均以平均值±标准差表示(n=3)。

2 结果与分析

2.1 起泡性

2.1.1 低pH下大豆蛋白组分起泡性的比较 从结果中可以看出,依据7S形成纤维结构的处理条件,4种大豆蛋白组分在pH2.0的条件下长时间加热,起泡性均有一定程度的提高,但是提高的幅度不同(p<0.05),其中7S、11S、酸性亚基和碱性亚基起泡能力的提高幅度分别为132.32%、122.54%、140.83%和48.76%(图1a);同时,泡沫稳定性提高的幅度分别为61.69%、50.35%、35.55%和29.01%(见图1b)。这种改善与是否能够形成纤维聚合物无关,因为Tang[3]等人研究发现7S较11S具有更强的纤维化能力,因此,对于形成纤维聚合物的7S和不能形成纤维结构的11S,以及由11S解离出来的酸性亚基和碱性亚基均有很大程度的改善。说明低pH条件下长时间加热的处理手段可以显著改善4种大豆蛋白组分的起泡性。具有良好起泡性能的蛋白具有的特征之一是通过分子相互作用形成黏性膜[1],而Akkermans等人发现在低pH下加热形成的纤维聚合物使得黏度增加[11],这些可以解释在低pH下加热4种大豆蛋白可以改善其起泡性。

图1 低pH条件下4种大豆蛋白组分热处理前后起泡性的差异Fig.1 The foaming properties offour soy protein components at low pH注:同一图上字母不同表示差异显著(p<0.05);图2～图4同。

2.1.2 不同pH下起泡性的差异 从图2的实验结果可以发现,无论是形成纤维聚合结构的7S还是不能形成纤维结构的11S,在加热20 h后,pH2.0条件下7S和11S的起泡能力显著(p<0.05)高于pH7.0条件下的起泡能力。7S和11S在pH2.0条件下形成的聚合物的起泡能力分别是pH7.0条件下形成聚合物的起泡能力的2.37倍和6.32倍;7S和11S泡沫稳定性分别是pH7.0条件下的1.79倍和4.16倍。说明低pH条件下7S和11S形成的热聚物结构更有利于改善其起泡性,这种聚合结构不仅仅局限于纤维结构。Martinez等人[12]研究发现在糖基化的酪蛋白和明胶混合体系中pH3.5和pH6.5条件形成不同的复合体使得其起泡性存在不同。因此,7S和11S在不同pH下具有不同的起泡性,可能也是因为两者在不同pH下形成的聚合物结构不同。

图2 不同pH下7S和11S起泡性的差异Fig.2 The foaming properties ofsoy protein 7S and 11S at different pH

2.2 乳化性

与起泡性的结果不同,低pH的处理手段并没有对7S和11S的乳化性存在一致的改善作用。与pH7.0的结果相比,在pH2.0条件下7S形成的纤维聚合结构降低了乳化活性,同时也降低了乳化稳定性;11S在低pH条件下热聚合的非纤维聚合结构提高了其乳化活性,但是,热处理前后的乳化稳定性显著(p<0.05)降低,降低幅度明显高于pH7.0的结果(图3)。如果将11S解离为酸性亚基和碱性亚基,碱性亚基乳化活性有所提高(p<0.05),但酸性亚基变化不明显(p>0.05),对于乳化稳定性而言,与11S不同,酸性亚基和碱性亚基相对热处理之前均有明显提高(图4)。总之,低pH的处理手段对7S和11S(包括酸性亚基和碱性亚基)乳化性并没有一致的改善作用。王金梅等人[13]发现在低pH(酸性)条件下长时间加热大豆蛋白可以不同程度的增加其界面活性,但是其形成的纤维聚合物对其乳化液的性质和稳定性并没有明显的改善。

图3 不同pH下7S和11S乳化性Fig.3 The emulsifying properties ofsoy protein 7S and 11S at different pH

2.3 表面疏水性

从实验结果可以看出,在加热过程中,pH7.0条件下的7S和11S的表面疏水性明显低于pH2.0条件下的7S和11S的表面疏水性(图5)。不同pH下7S和11S蛋白质表面疏水性的变化与其起泡性能和乳化性能有着密切的关系,低pH条件下热处理2 h后7S和11S蛋白质分子表面疏水性最高,有更多的疏水氨基酸残基暴露,随后表面疏水性虽有一定降低,但是,依然显著高于pH7.0时7S和11S的热聚合变化,这种蛋白质结构的变化结果使7S和11S的起泡性显著(p<0.05)改善,特别是起泡能力有大幅度提升,而疏水性的这种变化对乳化活性的改善不显著(p>0.05)(表1)。乳化性的结果与Zhang等人[14]发现的在不同pH下乳化活性和表面疏水性是相互独立的结果一致。

表1 不同pH下7S和11S加热后起泡性和表面疏水性的关系

图4 4种原料在pH2.0条件下的乳化性Fig.4 The emulsifying properties offour soy proteincomponents at pH2.0

图5 不同pH下7S和11S加热过程中的表面疏水性Fig.5 The surface hydrophobicity ofsoy protein 7S and 11S at different pH

注:
注:同列字母不同者差异显著(p<0.05)。

3 结论

低pH条件下长时间热处理的聚合手段,可以显著改善大豆蛋白7S和11S(包括酸性亚基和碱性亚基)的起泡性,对乳化性的影响不显著,这种改善与是否形成纤维聚合结构无关。低pH条件下长时间热处理与pH7.0条件下的热处理手段相比,能够使大豆蛋白7S和11S表面疏水性显著增加,这种结构的变化结果更有力于提高起泡性能。

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Superficial properties of soy protein 7S and 11S at low pH

XU Hong-hua,DONG Shi-rong,HE Xue-fei

(College of Food,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Based on the conditions of 7S forming fibril,the emulsifying and foaming properties of soy protein 7S and 11S(including acidic and basic subunits)was investigated under prolonged heat treatment at low pH. The results showed that the foaming properties of different soy protein components were significantly improved(p<0.05),while the emulsification was not sigificantly regular changed even the emulsion stability was reduced by heating treatment at low pH. There were no relationships between the fibrillar aggregates and modified properties. Compared with the heating treatment at pH7.0,the surface hydrophobicities of soy protein 7S and 11S were significantly increased under heating treatment at low pH,and the special structure with high surface hydrophobicities was benefit for improving foaming properties of soy protein. Then,the surface hydrophobicities and foaming properties of 7S and 11S were improved significantly after prolonged heat treatment at low pH.

soy protein;foaming properties;emulsifying properties;surface hydrophobicity;aggregation

2014-10-21

徐红华(1969-),女,博士,教授,从事食品蛋白质及营养的教学和研究，E-mail:dongshirong118@126.com。

国家自然基金项目(31471682)；黑龙江省教育厅青年学术骨干项目(1155G10)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)15-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.011