Nav1.5与β亚基互作：结构、功能和相关疾病

艾若松，吕小强，卜凡亨，赵赞延，姜 鸣,3，刘 霞，白占涛,3*

(1.延安大学生命科学学院；2.延安大学多肽资源药物研究中心；3.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，陕西延安716000)

在可兴奋细胞中，VGSCs负责动作电位的形成和传导。VGSCs由一个α亚基(240-260kD)构成孔道，两侧是辅助性的一个非共价偶联的β亚基(β1或β3)或一个共价偶联的β亚基(β2或β4)(33-36kD)[1]。哺乳动物α亚基有十个亚型，分别是Nav1.1-Nav1.9及NavX，基因编码为SCN1A-SCN11A及NavX，包含四个同源结构域(DⅠ-Ⅳ)，每个结构域有六个跨膜片段(S1-S6)，S4片段为电压感受器(VSDs，见封二图1)[2]。据其对河豚毒素(Tetradotoxin,TTX)的敏感性不同，分为河豚毒素敏感型(Tetrodotoxin-sensitive,TTX-S)钠通道和河豚毒素不敏感型(Tetrodotoxin-resistant,TTX-R)钠通道两大类。β亚基有五个亚型，分别是β1-β4及β1B，基因编码为SCN1B-SCN4B及SCN1B。β1亚基在人类染色体定位于19q13，β2和β4亚基定位于11q23，β3亚基定位于11q23。β亚基属Ⅰ型拓扑跨膜蛋白[3]，每个亚基包含一个胞外N端结构域，是与许多神经细胞黏附分子(CAMs)同源的免疫球蛋白(Ig)，一个跨膜片段和一个胞内C端[4]。β亚基在神经系统、心脏和骨骼肌等可兴奋细胞中表达[5]，也在星形胶质细胞、放射状胶质细胞和血管内皮细胞等不可兴奋细胞中表达[6]。β亚基调控α亚基的电学特性，包括如钠电流峰值密度、电压依赖性激活和失活、在细胞和特异性组织中持续性钠电流和钠电流从失活中恢复等。β亚基也与细胞迁移、神经突增长以及轴突向导等α亚基所缺失的许多功能相关。尽管VGSCs单独表达α亚基时也会形成Na+内向电流(INa)[7]，但β亚基共表达时更接近生理条件下VGSCs的动力学和门控特性[8]。

Nav1.5是主要的心脏钠通道，高表达在心肌闰盘、脑和胃肠平滑肌[9]，属于TTX-R钠通道。β亚基有助于Nav1.5在闰盘上定位，调控Nav1.5与胞外基质，肌动蛋白及细胞骨架相关分子相互作用[10]。目前已发现大量SCN5A突变与各种罕见的心律失常综合症密切相关[11]。当Nav1.5孔道DⅠ的Phe变为Cys可使孔道对TTX的敏感性降低200倍[7]。Nav1.5的电生理学调控特征研究表明，动作电位改变和心律失常易损性增加与Nav1.5表达水平和表面钠电流密度相关。比如，β1亚基调控Nav1.5表面的电流密度和门控特性，表现为峰值电流的增加，使α亚基从静息状态中恢复得更快。遗传病理学显示，β亚基表达改变与各种疾病密切相关。哺乳动物心脏中β亚基表达定位于心肌细胞不同部位(心室细胞的夹层、心房细胞的夹层、T管及闰盘)，在细胞表面调控着离子的传导，锚定化合物向胞内蛋白，并直接调控α亚基的门控特性[12]，因此其功能丧失会导致电生理特性异常，更易心律失常[13]。由此推测Nav1.5与β亚基之间一定存在某种或某些相互作用关系，因此，本文就目前已有的关于Nav1.5与β亚基互作的结构、功能和相关疾病展开叙述。

1 β亚基与Nav1.5互作组合

许多疾病的发生、发展过程中都需要β亚基的参与，β亚基不同亚型对于同一α亚基的作用并不相同。那么β亚基不同亚型或不同亚型组合是否都能与心肌Nav1.5产生互作，互作结果如何等都需深入研究。β1亚基和β3亚基通过N端和C端与α亚基非共价作用，调节通道的门控特性，表现为加快钠电流的失活以及从失活中恢复、增加钠电流的振幅[14]。β1亚基定位于心室细胞的夹层、T管及心房细胞的闰盘[15]，其调节α亚基的门控特性主要依赖于胞外区，通过改变DⅣ-VSD的传导来调控Nav1.5的失活，通过DⅢ和DⅣ的VSDs作用，使Nav1.5从失活中恢复得更快。其次，β1亚基的跨膜区对于Nav1.5通道电流的增加和加快其从失活中恢复也有作用。β1亚基还能够干扰脂肪酸、药物或者天然毒素对α亚基的作用。SCN1B敲除后小鼠心脏SCN3A和SCN5AmRNA表达增加[16]。β1B亚基定位于心房和心室心肌细胞，在细胞连接中尤为重要。β 1B亚基在不同细胞中调控α亚基，增加钠电流并且使电压依赖性激活和失活向超极化方向移动[17]。β1B亚基表达在心脏时，与α亚基一起留在细胞表面并且增加α亚基的表达。β3亚基定位于心室心肌细胞的T管和心房细胞的闰盘。β3亚基与Nav1.5在CHO细胞上共表达时导致电压依赖失活曲线负移并减慢失活[18]。增加胞外分子二硫键，β3亚基使得蛋白更加稳定。β1亚基和β3亚基的胞外区域结合在Nav1.5通道α亚基C末端的相似位点。β3亚基的晶体结构显示为同聚二聚体形式，Nav1.5包含多个位点与β3亚基相互作用并可能形成低聚复合物。虽然β1亚基和β3亚基同源水平较高，但只有β3亚基与Nav1.5共同作用能形成这种低聚物，而β1亚基则不能。

笔者通过全序列比对分析得到共价偶联的β2亚基和β4亚基有35%(见封三图2C)的序列同源性，这与文献报道一致。β4亚基与β1亚基和β3亚基只有20%～22%的同源性。β2亚基和β4亚基可单独通过胞外Ig环的N端Cys与α亚基S5～S6的Cys共价作用[11](β2：Cys-26[19]，β4：Cys-58[20])。β2亚基定位于心肌细胞的闰盘或T管和心房细胞的T管。β2亚基诱导Nav1.5向超极化门控移动，即有唾液酸依赖。β1亚基和β2亚基能够促进细胞粘着，而β3亚基无此功能。β4亚基定位于心室心肌细胞的闰盘。β4亚基与Nav1.5在HEK293细胞共表达诱导电压依赖失活曲线负移[21]。

综上，β亚基与Nav1.5可产生互作，但互作位点、互作机制尚不明确，且关于β亚基与Nav1.5互作组合的研究较少。于是，我们利用NCBI的Blast对人源β1～β4亚基进行了氨基酸全序列比对分析(见封三图2A)。分析发现，β1～β4亚基氨基酸序列组成主要为V位点、Ig-P0蛋白相似位点，IGv和DUF1191，其他区域尚不明确。V位点主要存在于抗体、神经蛋白P0和CTL4中；P0是一种单跨膜糖蛋白，具有高度碱性的胞内结构域和胞外结构域，P0的胞外结构域和Ig的可变结构域相似，携带一个受体序列进行N端连接糖基化；IGv是Ig的V型；DUF1191假定为植物蛋白的未知片段。随后，我们分别比对了非共价偶联的β1亚基和β3亚基(见封三图2B)以及共价偶联的β2亚基和β4亚基(见封三图2C)，对其跨膜结构及信号肽进行了预测。发现β1亚基和β3亚基的胞外区、跨膜区、胞内区及信号肽序列基本对应。而β2亚基和β4亚基的比对结果显示出较大差异。那么结构组成相似的β亚基在疾病情况下的表现是怎么样的，有待于进一步讨论。

2 β亚基与Nav1.5互作组合的相关疾病

SCN5A突变影响心脏钠通道的克隆和表达，从而引起其结构和功能的改变，由此引发心脏各种离子通道病，包括长QT综合症(Long QT syndrome,LQTS)、布鲁格达症候群(Brugada syndrome,BrS)、进行性心脏传导疾病(Progressive cardiac conduction defect,PCCD)、扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)、病窦综合症(Sick sinus syndrome,SSS)、房颤(Atrial fibrillation,AFib)、婴儿猝死综合症(Sudden infant deathsyndrome,SIDS)和重叠综合症等[13]。值得注意的是，临床患者上偶尔发现β亚基编码的基因调控蛋白与SCN5A突变所导致的心律失常疾病具有一定的相似性，这反应了β亚基在心脏钠通道所致疾病中的重要性。

2.1 长QT综合症

LQTS在临床上表现为QT间期延长和T波异常，易产生恶性心律失常，导致反复发作性晕厥、心脏骤停甚至猝死等心脏不良事件。延长QT间隔主要反映在心室肌细胞动作电位持续时间增加以及心室复极延迟。LQTS能够增加室性快速心律失常猝死的风险，尤其尖端扭转型室性心动过速。遗传性的LQTS分为不同的类型，每种类型都与蛋白质(直接的或间接的调控蛋白，比如β亚基)基因突变有关。长QT综合症3型(LQT-3)与SCN5A突变密切相关，约占LQTS的13%[22]。这些突变大多数为错义突变，通过破坏钠通道快速失活以及导致持续性钠电流来调控钠通道的门控功能。突变导致持续性钠电流主要发生在Nav1.5的快失活区域，如DⅣ的S4片段，DⅢ～DⅣ的连接段以及DⅢ和DⅣ的S4和S5片段间的连接环，或者是快失活稳定区，如C末端。C末端可能与DⅢ～DⅣ的连接段相互作用来稳定孔道的失活[23]。几种不常见的LQTS是由于Nav1.5的调控蛋白表达或功能上的改变所致。由SCN4B编码的β4亚基错义突变，第179位由Leu突变为Phe，与长QT综合症10型LQTS-10相关，当其与SCN5A共表达时，使其失活曲线向正电位移动，但不改变其激活，这导致了膜电位对应的动作电位三段窗口电流的增加[24]。当β1B亚基错义突变，C端213位由Pro突变为Thr后与Nav1.5共表达，导致持续性钠电流和动作电位持续时间增加、窗口电流位移以及慢失活速率降低。利用SCN1B敲除小鼠检测β1亚基在心脏兴奋性中的作用，与野生型小鼠相比，SCN1B敲除小鼠记录的心电图显示出更长的RR间期和延长的QT间隔。在急性分离的心室肌细胞，SCN1B丧失表达后峰值和持续钠电流增加约1.6倍，而门控动力学未受影响[25]。这表明β1亚基的丧失与长QT综合症密切相关。

2.2 布鲁格达症候群

BrS在临床上主要表现为由室性心动过速(多态性心室心动过速和室颤)所导致的猝死风险增高，伴有右侧心电图导联V1-V3的持续性ST段升高。心电图的变化通常是隐藏的，但可以通过1A和1C型抗心律失常药物如阿吉吗啉，吡西卡胺等(钠通道阻滞剂)测试，表明抑制钠电流在BrS病理生理学上的关键作用。10%～30%的BrS患者是由于SCN5A基因突变，包括错义突变，无义突变和核苷酸缺失或插入。几乎所有的突变都是蛋白异源表达(<50%)导致的钠通道功能丧失如峰值钠电流减小，或蛋白表达降低，非功能性通道区表达以及门控功能丧失[3]。SCN5A基因的错义突变，导致DⅢS5和S6之间1406位的Gly突变为Arg而发生BrS[26]。其正常的肌膜定位表达也可能是由于β亚基或其他与突变Nav1.5相互作用的蛋白互作减少。在BrS上钠电流的减少可能是编码β亚基或者心脏钠通道调控蛋白的基因发生突变所致。SCN1B胞外Ig环87位高度保守的Glu突变为Gln后与BrS相关。当异源表达时β1亚基被截短，导致其无法与Nav1.5蛋白互作[20]。SCN2B错义突变，将211位的Asp突变为Gly与Nav1.5共表达时，导致细胞表面钠电流密度减少[27]。SCN3B错义突变，胞外区10位的Leu突变为Pro后扰乱了Nav1.5蛋白从内质网到肌膜上膜，使得钠电流减少，通道门控特性发生改变[28]。

2.3 进行性心脏传导疾病

PCCD在心电图上表现为传导参数P波、PR和QRS间期逐步延长，右束或左束支传导阻滞，没有ST段抬高或QT间期延长。完全的房室传导阻滞可能发展和导致晕厥或猝死。心电图的改变表明，通过心房，房室结、His束、浦肯野纤维和心室的电传导减慢，并伴随与年龄相关的退行性过程，其中纤维化仅影响心脏传导系统。遗传性的PCCD传导减慢可能是由于SCN5A基因突变而功能缺失，包括肌膜上通道蛋白表达减少、非功能性通道的表达或者门控特性改变，致使钠电流变低，从而延迟激活、更早失活、增强缓慢失活、或从失活中恢复变慢[13]。SCN5A突变既能导致PCCD的发生，也能导致PCCD与BrS同时发生。说明钠电流减少可导致PCCD或BrS的传导减慢。在SCN5A基因没有突变的PCCD患者中发现，有两个突变导致SCN1B丧失功能，一个突变截短了β1亚基，使其无法与Nav1.5蛋白相互作用，结果是钠电流密度增加、门控特性改变。另一个突变降低了β1亚基增加钠电流密度和易化共表达时钠通道激活的能力。有趣的是，正常的和突变的β1亚基在浦肯野纤维中表达的程度高于在心室中的表达，这说明浦肯野纤维肌细胞中钠电流的减少可能是PRCD和QRS间期的延长及PCCD中左右束传导阻滞的延长[29]。

3 结语

目前已知β1亚基与Nav1.5的DⅠ和DⅣ的S5-S6的胞外环相互作用，且β1亚基的作用区域为胞外区，根据跨膜结构，β1和β3亚基的胞外区位点相近且同源水平较高(β1亚基:1～153；β3亚基：1～152，图2B)，据此推测，β3亚基与α亚基发生互作也可能是通过胞外区进行的。当β3亚基的Leu10突变后导致BrS发生的机制改变，Leu10在β1亚基上对应的位置是Leu7，故推测β1亚基的Leu7也是其至关重要的功能位点。β2亚基的Cys55可与Nav1.2的DⅡS5-S6片段外环Cys910形成二硫键，在Nav1.5的Cys910同源的位置是Leu868[30]。根据序列比对(图2C)，β4亚基与β2亚基的Cys55同源的位置是Cys58，因此推测，β4亚基可能是通过Cys58与Nav1.2通道的Cys910发生互作。

大量体内外研究已清晰表明，在不同的生理病理、分子细胞微环境、钠通道β亚基多样性的内源性差异调控，可直接或间接改变钠通道的表达定位及门控特性。已有研究以毒素为配体切入，阐明钠通道、β亚基的药理靶向性及其与疾病的关联。钠通道β亚基互作组合研究已是药物研发和诊疗的新手段。因此，以β亚基为分子靶点，或使用β亚基特异性功能结构域片段来探索钠通道α、β亚基在决定不同细胞类型内在特性的差异性组合方式中的作用，仍将是极具挑战的重要课题，也必将为阐明靶向钠通道相关的疼痛、心室房颤、肿瘤等通道病的分子机制、临床诊疗和新药研发提供新策略和重要线索。