表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗氧化微乳液的制备与表征

王荣镇,李大伟,张士康,*,金青哲,朱跃进,王兴国,汪 辉

(1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州 310016;2.江南大学 食品学院,江苏无锡 214112;3.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室,浙江杭州 310016;4.浙江远圣茶业有限公司,浙江杭州 311121)

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗氧化微乳液的制备与表征

王荣镇1,2,李大伟1,3,张士康1,3,*,金青哲2,朱跃进1,3,王兴国2,汪 辉4

(1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院,浙江杭州 310016;2.江南大学 食品学院,江苏无锡 214112;3.浙江省茶资源跨界应用技术重点实验室,浙江杭州 310016;4.浙江远圣茶业有限公司,浙江杭州 311121)

以肉豆蔻酸异丙酯为油相,吐温80-司盘80复配表面活性剂(HLB为6)为表面活性剂,乙醇为助表面活性剂(Km值为4∶1)制备了油包水型的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗氧化微乳液,并对其稳定性和抗氧化活性进行考察。通过测定电导率鉴别微乳液类型,纳米粒度仪测定微乳液的粒径,考察25 ℃条件下贮藏时间对微乳粒径的影响,评价微乳液的稳定性。同时,采用氧化稳定仪测定EGCG微乳液在花生油和亚麻籽油中的抗氧化活性。结果表明,微乳液外观澄清透明,在25 ℃贮藏条件下的稳定性好,放置50 d后微乳液的粒径变化小,放置期间未出现分层、破乳现象,并且在植物油中表现出较好的抗氧化活性。

EGCG,微乳液,稳定性,抗氧化剂

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶叶中所含有的一类多羟基酚类化合物的总称,包括儿茶素类(黄烷醇类)、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分,约占茶多酚总量的65%～80%,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是儿茶素中含量最高的组分,占儿茶素含量的60%[1-2]。因为具有特殊的立体化学结构,EGCG具有非常强的抗氧化活性,不但强于常用的合成抗氧化剂如BHA、BHT和天然抗氧化剂VE、VC、β-胡萝卜素等,而且与VE、VC等具有较好的协同效应。但由于自身分子结构限制,水溶性好而脂溶性差,这就大大限制了其在油脂体系中的应用和发展[3-4]。

微乳液是一种透明、各向同性、热力学稳定的体系。通常由油相、水相、表面活性剂及助表面活性剂等构成。微乳液具有毒性小、安全性高、不需特殊设备即可大量生产等优点,因而已被广泛应用于药物、化妆品、食品等行业中。非脂溶性的物质可以通过反相微乳液的方法来提高其在油脂中的溶解度[5-7]。传统的方式是首先将物质溶解于水,然后作为水相添加到微乳液中。考虑到以上情况,利用反向微乳液来增加EGCG在油脂中的溶解是一个简单而有效的方法,反相微乳液法不但不会改变EGCG的结构,而且缓释作用可以进一步增强其抗氧化效果。而以微乳液为EGCG载体的研究报道尚不多见。本研究以肉豆蔻酸异丙酯为油相,span80-tween80为表面活性剂,乙醇为助表面活性剂制备EGCG反相微乳液,以增加其脂溶性,提高其在油脂及高含脂食品等方面的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

EGCG(纯度95%) 杭州茶叶研究院;Tween80、Span80、肉豆蔻酸异丙酯、辛癸酸甘油三酯、油酸乙酯均为化学纯 国药集团试剂有限公司;乙醇(分析纯) 国药集团试剂有限公司;水为去离子水;鲁花浓香花生油 购自家乐福超市;亚麻籽油(无抗) 金利油脂(苏州)有限公司。

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器 上海比朗仪器有限公司;DDS-11A数显电导率仪 上海雷磁仪器厂;Zetasizer Nano S纳米粒度分析仪 马尔文仪器有限公司;743-Rancimat氧化稳定测定仪 瑞士万通。

1.2 实验方法

1.2.1 相图的绘制 滴定法制备伪三相图:采用加水滴定表面活性剂,助表面活性剂以及油相的混合物的滴水法来绘制微乳的伪三元相图。将混合表面活性剂和油相按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9(w/w)的9种不同比值在锥形瓶中称量,滴加去离子水直至溶液由浑浊变为澄清或由澄清变浑浊,记录转变点的加水量,分别计算混合表面活性剂、油相和水相在临界点的质量分数,用Origin8.5绘制微乳的伪三元相图。

1.2.2 电导率的测定 电导率测定是区分微乳类型的常用方法。通常,在油相/表面活性剂/乙醇/水相的微乳系统中,W/O型微乳中水相作为分散相通过液滴的相互碰撞形成导电链,随着含水量增加导电链逐渐增多电导率值迅速上升,在O/W类型中水相作为连续相,随着含水量增加,微乳逐渐被稀释造成其电导率值的迅速下降。实验在25 ℃条件下以肉豆蔻酸异丙酯为油相,span80-tween80(HLB=6)为表面活性剂,以乙醇为助表面活性剂,Km值4∶1的体系中,混合表面活性剂(CSC)和肉豆蔻酸异丙酯(IPM)的比值分别是3∶7、4∶6和5∶5 时,在磁力搅拌作用下,逐滴滴加去离子水,每次滴加后,充分搅拌均匀再读数,同时记录滴加去离子水的质量,从而绘制电导率随水相质量的变化曲线,直至体系混浊。

1.2.3 微乳液粒径和多分散度的测定 在25 ℃条件下,将样品稀释,用马尔文纳米粒度分析仪测定微乳样品的粒径大小,测定微乳的平均粒径大小以及多分散指数(PDI)。

1.2.4 EGCG微乳液对植物油的抗氧化效果 分别按亚麻籽油和花生油重量的0、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%的比例添加EGCG微乳液(按EGCG量计),准确称取5 g配制好的添加EGCG微乳液的植物油置于反应管中,在120 ℃,通气量20 L/h的条件下,测定油脂的氧化诱导时间。

1.3 数据统计分析

每个实验至少重复三次,结果取平均数,所有数据绘图均采用origin8.5处理。

2 结果与分析

2.1 微乳液相图的绘制

2.1.1 不同HLB值的微乳液相图 采用肉豆蔻酸异丙酯为油相,乙醇为助乳化剂,Km值为4∶1,在由span80-tween80复配成不同HLB值条件下,绘制伪三相图,结果如图1所示,随着HLB值的增大形成微乳面积出现先增加后减少的趋势。其中,HLB值=6、7时形成微乳面积相对较大,HLB值为5时,相区面积很小。分析可能是过低HLB值的表面活性剂亲水性较弱,不利于表面活性剂和水相之间氢键的形成,降低了微乳的载水量从而影响了微乳相区的面积;而过高HLB值由于亲油性较弱,不利于在界面层与油相相互渗透形成胶束,从而影响了微乳的形成能力。同时考虑到较低HLB值有利于W/O型微乳的形成,所以选择HLB=6为制备微乳的最优值。

图1 Tween80-Span80在不同HLB值下对微乳面积的影响Fig.1 Effect of HLB value on the area ofmicroemulsions for Span80-Tween80注:(A)HLB=5；(B)HLB=6；(C)HLB=7；(D)HLB=8；(E)HLB=9。

2.1.2 不同Km值对微乳区面积的影响 表面活性剂和助表面活性剂之间的比值(Km)是影响微乳相区面积的重要因素。采用肉豆蔻酸异丙酯为油相,乙醇为助乳化剂,span80-tween80(HLB=6)为乳化剂,改变Km值,绘制伪三相图,考察Km对微乳相区面积的影响。通过图2可观察到,表面活性剂和助表面活性剂的比例影响了微乳的形成。微乳相区面积随着Km值的增加先增大后减小,当Km值为4∶1时,微乳区面积明显增大,可能原因是Km值达到最佳,助表面活性剂正好完全嵌入表面活性剂中,将表面活性剂的HLB值调整到最优值使其更接近于油相的HLB值从而有利于微乳的形成,进而使得微乳载水量增大,增溶空间增大。

图2 不同Km对微乳面积的影响Fig.2 Effect of Km value on thearea of microemulsions注:(A)Km=2∶1；(B)Km=3∶1；(C)Km=4∶1；(D)Km=5∶1；(E)Km=6∶1。

2.1.3 不同油相对微乳液面积的影响 以span80-tween80(HLB=6)作为表面活性剂,乙醇作为助表面活性剂,Km值为4∶1,选择食品研究中比较常见的油相制备微乳,通过对比找出最佳油相。结果见图3,以肉豆蔻酸异丙酯作为油相可以获得最大的微乳相区面积,而辛癸酸甘油三酯和油酸乙酯形成的微乳区面积较小,究其原因可能是不同油相的疏水能力之间的差异,导致油与表面活性剂相互渗透形成界面膜的能力不同,进而影响微乳的形成。

图3 不同油相对微乳面积的影响Fig.3 Effect of oil phase on the area of microemulsions注:(A)OL；(B)GTCC；(C)IPM。

2.2 电导率法鉴别微乳类型

采用电导率仪分别考察CSC和IPM比值为3∶7、4∶6和5∶5时的电导率随着含水量的变化趋势。如图4所示,沿着CSC∶IPM=4∶6的电导率变化曲线,在滴定的最初阶段,体系澄清,电导率随极性相含量增加而快速增加,则该区域为油包水微乳区,在转折点处体系极性相质量含量为13.6%,之后体系开始浑浊,电导率呈下降趋势,且出现一个最小值,可能是该区域为液晶相区,当体系离开液晶区进入两相区时,其电导率呈非线性增加;之后的电导率变化趋势由于与本实验关系不大,所以没有予以考察。通过对微乳电导率的测定可以进一步确定实验所制备微乳的类型为油包水微乳液,同时,从图中可以看出,当CSC∶IPM=3∶7时,微乳的电导率增长最为缓慢,且在本实验条件下电导率没有达到最大值,而CSC∶IPM=4∶6,CSC∶IPM=5∶5时,电导率都是先增大后减小,说明这两者在实验后期已经不是油包水微乳液,相比之下,CSC∶IPM=3∶7时微乳液的载水量最大。

图4 不同含水量下Span80-Tween80(HLB=6)微乳体系导电率的变化Fig.4 Variation of the electrical conductivity(k)as a functionof water content(g)for Span80-tween80 system

2.3 EGCG的添加对微乳粒径的影响及稳定性考察

图5 Span80-Tween80(HLB=6)微乳体系的粒径和PDI随时间的变化Fig.5 Effect of storage time on drop size and PDI ofmicroemulsions for Span80-tween80 system

平均粒径及多分散度是考察微乳液稳定性及粒径均一性的重要参数。随着微乳液粒径的减小,微乳液中分散粒子的相互作用增大,微乳液将更加稳定。由图可知,新鲜配制(第1天)的空白微乳液(CSC∶IPM=3∶7)粒径为27.99 nm,多分散指数为0.075。而新配制的两种不同油乳比,不同质量分数的EGCG微乳的粒径反而比空白微乳粒径小,但是多分散指数增大。这是可能是由于EGCG增溶到微乳液液滴球型的内核里,提高了水相的极性,使得其与表面活性剂极性基团之间的吸引力增大,从而导致微乳液粒径变小。微乳液中加入EGCG后,PDI值增大,且随EGCG质量浓度的增大而增大,原因是EGCG质量浓度越高,越容易吸附聚集,体系混乱度增加,液滴尺寸向非均匀性发展,多分散指数增大。同时考虑微乳的载水量,粒径和黏度等指标,最终确定CSC∶IPM=3∶7。

2.4 EGCG微乳液对植物油的抗氧化效果

分别在花生油、亚麻籽油中添加50、100、150、200 μg/L的EGCG微乳(以微乳中EGCG含量计),考察其在植物油中的抗氧化活性,结果如图6、图7所示,EGCG微乳在油脂中的抗氧化效果非常明显,其在花生油中其抗氧化效果稍弱于TBHQ,在花生油和亚麻籽油中其抗氧化效果都明显优于BHT。

图6 不同抗氧化剂在花生油中的OSI值Fig.6 Effect of different antioxidantson OSI value of peanut oil

图7 不同抗氧化剂在亚麻籽油中的OSI值Fig.7 Effect of different antioxidantson OSI value of linseed oil

3 结论

通过三元相图的方法,考察了span80-tween80不同配比形成的HLB值,油相的选择,表面活性剂与助表明活性剂的比值(Km值)对微乳相区面积的影响,最终确定HLB值为6,IPM为油相,Km值为4∶1为微乳制备的最佳配比。在室温条件下的粒径测定实验和50 d的常温储存实验证明其具有较好的稳定性,CSC∶IPM=3∶7时,平均粒径在15 nm左右,PDI值稳定在0.2左右,微乳的载水量相对于CSC∶IPM=2∶8时大,而黏度比CSC∶IPM=4∶6时的小。通过反相微乳液法将EGCG包封于IPM中,较大的提高了EGCG的油溶性,并表现出较强的抗氧化活性,拓宽了EGCG的应用范围,为其进一步开发和应用打下理论基础。

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Preparation and characterization of epigallocatechin-3-gallate (EGCG)antioxidant microemulsion

WANG Rong-zhen1,2,LI Da-wei1,3,ZHANG Shi-kang1,3，*,JIN Qing-zhe2,ZHU Yue-jin1,3,WANG Xing-guo2,WANG Hui4

(1.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3.Zhejiang key laboratory of transboundary applied technology for tea resources,Hangzhou 310016,China;4.Zhejiang Yuansheng Tea Co. Ltd.,Hangzhou 311121,China)

EGCG water in oil(W/O)antioxidant microemulsion(ME)was prepared by use of isopropyl myristate as oil phase,tween 80 and span 80(HLB 6)as surfactant,ethanol as cosurfactant(Km 4∶1),and its stability and antioxidant activity were studied. The type of ME was identified by measuring the electrical conductivity,and the stability of ME was evaluated through measuring the size of ME and the impact of storage time on the ME size under 25 ℃ condition. The antioxidant activity of ME was measured by Rancimat oxidative stability analyzer in peanut oil and flaxseed oil. The results showed that the appearance of the ME was clear and transparent,the ME size changed little and exhibited good stability when stored at 25 ℃ for 50 d,meanwhile,the ME had strong antioxidant activity in vegetable oil.

EGCG;microemulsion;stability;antioxidants

2014-10-11

王荣镇(1989-),男,在读硕士研究生,研究方向:天然抗氧化剂,E-mail:wrz9271@163.com。

*通讯作者:张士康(1965-),男,工学博士,高级工程师,研究方向:长期从事食品资源开发、农副产品加工与流通等研究,E-mail:zsk6510@126.com。

“十二五”国家科技支撑计划课题(2012BAD36B06);杭州市城乡区域发展科技支撑专项(20121233F06)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)15-0261-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.046