富组氨酸糖蛋白基因多态性与中国妇女卵巢反应性的相关性初探

金白灵，牛志宏，冯云＊

（1.上海交通大学附属瑞金医院生殖中心；2.上海交通大学医学院瑞金临床医学院，上海 200024）

体外受精（IVF）能够成功的关键步骤之一，是通过使用外源性促性腺激素（Gn），使卵巢内多个卵泡同时发育，得到数个高质量的卵母细胞。卵巢对Gn的反应性受到多种因素的影响，如年龄、体重指数（BMI）、基础卵泡刺激素（FSH）、抗苗勒管激素（AMH）、窦卵泡计数（AFC）等。其中，目前公认预测卵巢反应性最可靠的指标为AMH 和AFC［1］。然而，即使在AMH 和AFC 均无异常的年轻患者中，仍有15%左右会对Gn出现“意料之外”的反应不佳，提示存在上述指标以外的因素能够影响卵巢的反应性［2］。

近年来基因多态性的研究使人们对个体化差异有了更深入的认识，而基因测序技术的普及也使得个体化治疗成为趋势。在辅助生殖方面，搜寻影响卵巢反应性的基因多态性，为个体化制定促排方案提供依据是近年来的热点之一。目前已知有FSH受体［3］、雌激素受体［4］、黄体生成素（LH）［5］等基 因的多态性可能影响卵巢对外源性Gn的反应性。

本文所研究的富组氨酸糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）基因，因其在血管形成和凝血通路上的重要作用而被广泛研究［6］。该基因重要的多态性位于633 位点上，C 被T 替代，使其编码的蛋白相应位置上脯氨酸被丝氨酸替代，而后者可以被高度糖化，可能影响到该蛋白的稳定性甚至生理功能［6］。近期国外一些小样本研究发现，相较于HRG C／C、C／T 基因型，T／T 基因型的女性临床妊娠率较低，复发流产的危险性较高，在体外受精前的超排卵周期中获卵数减少［7-9］。本文旨在探索HRG多态性对中国不孕女性超排卵周期结局的影响，为个性化制定促排方案、提高卵巢反应性提供新的思路。

资料与方法

一、研究对象

2014年1月～6月在我院接受体外受精-胚胎移植（IVF-EF）助孕的中国汉族女性，共纳入107名女性。

1.纳入标准：（1）中国汉族女性；（2）输卵管因素为唯一的IVF 指证；（3）月经周期规律；（4）年龄≤36 岁，18＜BMI＜26kg／m2；（5）基础FSH≤10U／L；（6）男方精液符合WHO 2010年第5版正常精液标准；（7）采用黄体期长方案促排；（8）使用第一代IVF技术。

2.排除标准：（1）单卵巢；（2）多囊卵巢综合征（依据2003 年鹿特丹诊断标准）；（3）存在直径≥2cm的卵巢囊肿；（4）输卵管积水。

二、控制性超排卵与IVF

1.促排卵方案：于超排卵周期前一周的黄体中期（预计月经来潮前7d）起，使用GnRH 短效激动剂（达必佳TM，Ferring，Germany）降调节，起始剂量每天0.1 mg 肌 肉 注 射，使 用7d 后 减 少 至 每 天0.05mg肌肉注射，持续至取卵日。超排卵周期第3天起，根据女性年龄、BMI、基础性激素水平、窦卵泡计数（AFC）制定初始Gn剂量，150～300U／d，药物选择rhFSH（果纳芬TM，Merck Serono，Swiss），适当添加尿人绝经期促性腺激素（HMG，贺美奇TM，Ferring，Germany）。用药后第4～5天起隔两天或隔天监测血清雌激素、孕酮和LH 水平，并经阴道超声监测卵泡生长情况，以观察药物效果并个体化调节后续用药剂量。当直径≥1.8cm 的卵泡数量≥3枚时，当晚肌肉注射人绒毛膜促性腺激素（HCG，珠海丽珠）5 000～10 000 U，注射后36h 行阴道B超，经阴道穿刺取卵术。

2.IVF及胚胎评分：取卵后4h，将用改良上游法处理后的精子加入到含有卵冠丘复合体的培养皿中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。受精后18 h脱去卵母细胞周围的颗粒细胞，观察原核形成情况，观察到双原核（2PN）出现为正常受精。取卵后72h根据胚胎的卵裂球数目、大小均一性及碎片程度进行胚胎形态学评分［10］：（1）卵裂球数目：8～10为4分，6～7为3分，5为2分，≤4为0分；（2）卵裂球的对称性：卵裂球大小均匀或略不均匀为1分，不均匀为0分；（3）碎片评分：碎片占胚胎体积＜5%为4分，5%～10%为3分，11%～25%为2分，26%～50%为1分，＞50%为0 分。3 部分得分总和即为胚胎评分，≥5分视为优质胚胎。受精率：受精卵数／获卵数×100%；优质胚胎率：优质胚胎数／卵裂数×100%。

三、基因型测定

1.样本：取卵当天抽取2 ml静脉血，提取DNA，保存于-80 ℃待用。

2.引物：正向5’-ATTTTGAATTCTCATACTGCCTTA -3’；反向5’-CTCTT TCTTTTTTCTCTGTGACTCT-3’。

3.PCR：（1）反 应 体 系：50 μl体 系 中 含 模 板1μl，正反相引物各1μl，dNTP 10 mmol／L 1μl，Taq Buffer 5μl，Taq酶5U／μl 0.5μl，25mmol／L MgCl25μl；（2）反应条件：95 ℃预变性3min；94℃变性30s，55 ℃退 火35s，72 ℃延 伸40s，循 环35次，72 ℃延伸8min。

4.测序：PCR 产物纯化回收（生工SK1141试剂盒，生工生物工程），由生工生物工程（上海）公司测序。

四、统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料结果表示采用（±s），各基因组患者的基本特征资料及卵巢反应性指标的比较，采用各组两两间方差齐性检验后独立t检验；计数资料用个数（频率）表示，用卡方检验或Fisher精确分析法（当＞20%格子理论频数≤5时）进行比较；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、基因型测定结果

测序图谱见图1。C／C、C／T 及T／T 基因型各有31、70、6人，频率分别为30.0%、64.4%、5.6%。C和T 的等位基因频率分别为61.7%和38.3%。

各基因型患者的基本特征见表1。各组间患者的年龄、BMI、基础性激素水平、AFC 无统计学差异（P＞0.05）；原发不孕与继发不孕患者在各组的比例无显著差异（P＞0.05）。此外，纳入女性中仅5人（均为C／T 基因型）为第2次促排，其余均为首次接受促排卵患者。

箭头所示为HRG633 位点，蓝色单峰为C／C纯合子（下行），红色单峰为T／T 纯合子，红蓝套叠双峰且两峰高度差＜50%为C／T 杂合子（上行）。

二、各基因组患者促性腺激素（Gn）使用情况比较

C／C、T／T 及C／T 基因型患者Gn平均初始剂量分别为2.44 支、2.67 支及2.39支每天，各组间无统计学差异（P＞0.05）。促排总天数3 组相似（11.9dvs.11.7dvs.12.3d）。但T／T 组Gn总消 耗 量 显 著 高 于C／C 组（34.6 vs.26.4，P ＝0.021），与C／T 组比消耗量较大，但无统计学差异（34.6vs.28.3，P＝0.141）。此外，使用的Gn中，HMG 消耗量T／T 组同样显著高于C／C 组（14.0 vs.9.3，P＝0.047），与C／T 组相比差异无统计学意义（14.0vs.11.7，P＝0.42）。C／C 组与C／T 组的Gn总消耗量及HMG 消耗量无显著差异（P＞0.05）（表2）。

三、超排卵结局比较

T／T 基因型患者的获卵数（T／T vs.C／T，T／T vs.C／C分别为9.7vs.14.6，9.7vs.14.5，P 均小于0.05）、受精卵数（T／T vs.C／T，T／T vs.C／C 分别为6.1vs.10.2，6.1vs.11.0，P 均小于0.05）、优质胚胎数（T／T vs.C／T，T／T vs.C／C 分别为3.0vs.7.0，3.0vs.7.4，P 均小于0.05）均显著低于另外两种基因型患者（P＜0.05）。T／T 组的受精率 显 著 低 于C／C 组（63.7% vs.75.6%，P ＝0.034），与C／T 组相比无统计学差异（63.7%vs.71.1%，P＝0.314）。T／T 组优质胚胎率显著低于C／T 组（49.2%vs.68.7%，P＝0.04），较C／C 组低，但差异无统计学意义（49.2%vs.66.6%，P＝0.075）。C／T、C／C 基因型两组间上述结果均无统计学差异（P＞0.05）（表3）。

图1 HRG 基因测序图谱（片段）

表1 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者基本特征［（±s），n（%）］

表1 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者基本特征［（±s），n（%）］

基因型 例数 频率 年龄（岁） BMI（kg／m2）原发不孕 继发不孕C／C 31 31（30.0） 29.0±3.2 22.5±3.1 17（54.8） 14（45.2）C／T 70 70（65.4） 29.2±4.6 20.9±2.6 46（65.7） 24（34.3）T／T 6 6（5.4） 30.1±4.5 21.9±3.6 4（66.7） 2（33.3）基因型 例数 不孕年限 基础FSH（U／L） 基础LH（U／L） 基础E2（pmol／l） 窦卵泡数（个）C／C 31 3.4±1.5 7.0±1.3 4.6±2.5 129.5±67.2 13.8±3.2 C／T 70 2.5±1.4 7.3±1.9 4.2±1.3 157.1±34.1 12.5±3.0 T／T 6 3.5±2.0 8.3±1.4 5.2±2.7 132.5±64.6 13.7±3.1

表2 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者Gn使用情况比较［（±s），n（%）］

表2 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者Gn使用情况比较［（±s），n（%）］

注：与C／C组比较，＊P＜0.05

基因型 例数 频率 Gn初始剂量（支／d） Gn使用天数（d） Gn总消耗量（支） HMG 消耗量（支）C／C 31 31（30.0）2.44±0.63 11.9±3.8 26.4±6.2 9.3±4.0 C／T 70 70（65.4） 2.39±0.72 12.3±2.0 28.3±9.7 11.7±6.4 T／T 6 6（5.6） 2.67±0.68 11.7±2.3 34.6±13.3＊ 14.0±9.2＊

表3 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者超排周期结局的比较［（±s），n（%）］

表3 HRGC633TC／C、T／T 及C／T 基因型患者超排周期结局的比较［（±s），n（%）］

注：与C／C和C／T 组比较，＊P＜0.05；与C／C组比较，＃P＜0.05；与C／T 组比较，△P＜0.05

基因型 例数 频率 获卵数（枚） 受精卵数（枚） 优质胚胎数（枚） 受精率（%） 优质胚胎率（%）C／C 31 31（30.0） 14.5±4.6 11.0±3.8 7.4±3.3 75.6±11.4 66.6±20.3 C／T 70 70（65.4） 14.6±4.4 10.2±3.7 7.0±3.2 71.1±17.4 68.7±21.6 T／T 6 6（5.6） 9.7±2.3＊ 6.1±2.1＊ 3.0±2.0＊ 63.7±15.8＃ 49.2±26.3△

讨 论

HRG 蛋白广泛参与凝血、免疫、细胞凋亡、血管形成等生理过程［6］，而上述过程对于卵泡发育、成熟、胚胎发育等至关重要。值得一提的是，已有研究发现HRG 蛋白同样存在于卵泡液中［11］。

HRG 蛋白存在两个异构体，残端分别为丝氨酸和脯氨酸，前者可以被高度糖化，因此质量相对较大，可以在免疫蛋白电泳中与另一异构体分离。两个异构体是由于第633位上C／T 多态性，因此存在3个基因型：C／C，C／T，T／T。前期研究表明，T／T基因型女性的妊娠率较其它两型低［9］，而复发性流产危险性增加［7］，使该基因多态性在女性辅助生育领域初受关注。近期Nordqvist等［8］的一项研究统计了67位因不明原因不孕接受IVF 的白人女性，发现T／T 基因型的患者获卵数较少，提示该基因型可能影响了卵巢反应性。

本研究为在中国人群中研究HRG 多态性对超排卵周期结局的影响。共纳入了107名在本中心接受体外受精辅助生育，并接受长方案促排的不孕女性，按C／C、C／T、T／T 3种基因型分组。各组患者的年龄、BMI、基础性激素水平、AFC 都在正常范围，且各组间上述指标无差异，而原发与继发不孕在各组的比例相似，基本排除了这些因素对结果的影响。T／T 基因型的患者，即使Gn总消耗量高于C／T 组和C／C 组，获卵数却明显少于另外两组，提示T／T 基因型可能影响了卵巢的反应性。该发现支持了Nordqvist等［8］的研究结果。进一步分析，T／T 基因型患者的受精卵数和优质胚胎数也显著低于于另外两组，而该差异不仅是基于获卵数的减少，也和T／T 基因型的受精率及优质胚胎率降低有关，在本研究保证了精子质量的前提下，提示T／T 基因型可能也影响了卵母细胞质量和胚胎发育。

HRG633T 多态性编码的蛋白，在204位上为丝氨酸，使该位点可被糖化［12］，而该糖化反应可能影响了HRG 蛋白与多个配子或其它细胞因子之间的相互作用。已知HRG 通过与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）共同作用参与了血管生成过程［13］，而血管形成过程对卵泡和卵母细胞发育至关重要［14］。另有研究比较了受精卵母细胞和未受精卵母细胞对应的卵泡液多肽谱，发现在未受精卵母细胞对应的卵泡液中，硫酸乙酰肝 素 蛋 白 聚 糖（Heparan sulfate proteoglycan，HSPG）的表达明显增高［15］，而HSPG 与HRG 已被证实在血管形成过程中存在密切的相互作用［16］。Van Montfoort等［17］用全基因组扫描技术，比较了卵裂和未能早期卵裂的受精卵所对应的颗粒细胞基因表达谱，发现与细胞凋亡、FGF 信号通路、细胞因子信号通路、趋化因子信号通路有关的基因在两组间存在表达差异，而HRG 蛋白广泛参与了以上各过程和通路。HRG C633T 多态性可能通过上诉途径影响了卵巢反应性甚至卵母细胞质量及后续受精卵发育。

本研究的最大局限在于样本量不足，远小于理论所需最小样本量，但本研究严格筛选纳入人群，控制单一变量，一定程度上保证了结果的准确性和可信度。此外，本研究考虑到对妊娠率影响的多因素混杂，如新鲜移植周期／冷冻移植周期、移植前长降调、纳入患者广泛存在子宫内膜息肉、子宫肌瘤、子宫腺肌症等情况，因此未能探索不同基因型对着妊娠结局（着床率、临床妊娠率、流产率及抱婴率）的影响。后续研究可进一步扩大样本数，深入验证本研究结果，进一步讨论该基因型对种植率、妊娠率、流产率等的影响，并可结合VEGF等相关因子的基因多态性行多因素回归分析，为个体化制定治疗方案提供更可靠的证据。

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