高丛越橘组培快繁技术研究

李 森 ，高丽霞，刘 念 ，张施君*

(1.仲恺农业工程学院科技处，广东广州 510225;2.仲恺农业工程学院健康农业研究所，广东广州 510225;3.仲恺农业工程学院园艺园林学院，广东广州 510225)

越橘(Vaccinium spp.)是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生浆果类灌木，果实蓝色或红色，其中蓝果越橘俗称蓝莓。越橘果实皮薄，风味酸甜可口，含有丰富的花色素苷、黄酮等生理活性成分，具有增强心脏功能、预防癌症的功效，能防止脑神经衰老、增强脑力;可以强化视力，减轻眼球疲劳［1－2］。近年来，越橘在市场上受到追崇，目前生产栽培的主要类型包括兔眼越橘(Vaccinium ashei)、矮丛越橘(Vaccinium angustifolium)、高丛越橘(Vaccinium corymbosum)等［3］。

越橘的常规繁殖方法有播种、嫁接和扦插法，但播种繁殖发芽率低，嫁接繁殖成活率低，扦插繁殖的繁殖系数小，周期长，均难以满足市场对种苗的需求。利用组织培养来快速高效地获得大量无性系组培苗，是获取越橘优质种苗的有效途径。许多学者进行了兔眼越橘、高丛越橘、矮丛越橘等不同栽培类型的组织培养技术研究［4－8］。在越橘的组织培养中，常用的外植体包括叶片、茎尖和茎段。以叶片为外植体的再生体系需要经过叶片脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化成苗的芽间接再生途径［8－9］，这种芽再生方式常用于建立越橘的遗传转化体系。而通过茎尖或茎段的腋芽萌发形成不定芽的增殖体系属于芽直接再生途径，是越橘试管苗规模化快速繁殖的主要方法［10－11］。笔者以适合华南地区种植的高丛越橘‘比洛克西’的茎段为试验材料，探讨不定芽的直接再生方式，建立越橘的组培快繁体系，为试管苗规模化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试材料高丛越橘‘比洛克西’种植在仲恺农业工程学院农场，剪取当年生嫩枝为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 不同消毒条件对茎段诱导的影响。从农场采回试验材料，剪去叶片，切成约3 cm的茎段，用自来水加洗衣粉冲洗10 min，再用自来水冲洗10 min，在超净工作台上用75%乙醇浸泡30 s，再用无菌水冲洗1次，然后分别用0.1%的HgCl2(W/V)和5%的NaClO(W/V)为消毒剂浸泡处理，HgCl2的消毒时间分别设为3、4和5 min，NaClO的消毒时间分别设为5、10和15 min;消毒完成后用无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干茎段上的水分，将茎段接入WPM+ZT 0.5 mg/L的初代培养基中，每瓶接种4个外植体，每个处理5瓶，3次重复。接种30 d后，统计污染率和诱导率。污染率=污染外植体数/接种外植体数×100%;诱导率=无菌外植体数/接种外植体数×100%。

1.2.2 不定芽的继代增殖。将诱导获得的茎段分切成约2 cm，转接到分别附加不同组合和浓度6-BA、ZT、NAA的WPM和MS培养基上，每处理5瓶，每瓶接种4段外植体，3次重复。30 d后统计分枝数、不定芽数和增殖系数。增殖系数=不定芽数/接种芽数×100%。

1.2.3 试管苗的生根培养。将无菌苗分切成约2 cm，转接到WPM附加不同浓度IBA的培养基上进行壮苗和生根培养，每处理5瓶，每瓶接种4段外植体，60 d后统计生根率、生根数和根长，3次重复。

1.2.4 试管苗的移栽。用镊子将高达5 cm以上的试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中，浇透水，环境温度(22～25)℃，湿度80%，60 d后统计移栽成活率。

1.2.5 培养条件。以上培养基中均添加30 g/L蔗糖，6 g/L琼脂，pH 5.2，培养温度(25 ± 2)℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间 12 h/d。

1.3 数据分析 试验数据采用SPSS22软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒条件对茎段诱导的影响 由表1可知，5%Na-ClO的消毒效果不理想，茎段在5%NaClO中处理15 min后，污染率仍高达33.3%，与0.1%HgCl2处理3 min的污染率相当。用0.1%HgCl2只需处理4～5 min，即可得到较理想的灭菌效果，污染率降至20.0%以下。茎段经0.1%HgCl2处理4 min的效果最好，诱导率达68.3%，茎段接种在诱导培养基上(图1-1)，10 d后可见腋芽萌发，叶片逐渐展开，茎干伸长(图1-2)。

表1 不同消毒条件对茎段诱导的影响

2.2 不定芽的增殖培养 由表2可知，6-BA的浓度从2.0 mg/L增至5.0 mg/L，苗的分枝数、不定芽数和增殖系数有所增加;在培养基中再添加NAA，各项指标无显著变化，说明NAA的增殖效果不佳。ZT对越橘增殖培养的效果比6-BA显著，在培养基中添加适当浓度的ZT，茎段均有明显生长，萌发分枝和新芽，ZT的浓度从2.0 mg/L增至3.0 mg/L，各项指标无显著变化，说明ZT 2.0 mg/L是不定芽增殖的合适浓度(图1-3)。在ZT的基础上再添加NAA，苗的基部出现了少量愈伤组织，而分枝数、不定芽数和增殖系数均显著下降，说明NAA对不定芽增殖没有促进作用。WPM比MS培养基更适于越橘的离体培养，各项指标均明显高于MS培养基。

表2 不同培养基对增殖培养的影响

2.3 试管苗的生根与移栽 由表3可知，将高度约2.0 cm的苗转接至生根培养基上，不同浓度IBA诱导的发根率无显著差异，0.2 mg/L和0.5 mg/L IBA诱导出的根数和根长无显著差异，植株在IBA 0.2 mg/L的培养基上发根整齐，苗生长健壮(图1-4)。

试管苗移栽前3～5 d先将瓶盖打开，在培养室内炼苗，移栽时用镊子将试管苗夹出，用清水冲洗，然后移入泥炭土基质中，加遮阴网，温度控制在25℃左右，保持80% ～90%的相对湿度，移栽成活率达到80%(图1-5)。

表3 不同IBA浓度对试管苗生根的影响

3 结论与讨论

0.1%HgCl2和5%NaClO是植物材料常用的消毒剂［12－13］。该试验结果表明，HgCl2处理越橘茎段 3 ～5 min，诱导成功率达60%以上，而NaClO则需要15 min才能达到较好的消毒效果。在继代增殖培养中，ZT比6-BA更有利于越橘增殖，ZT 2.0 mg/L适宜越橘增殖培养，NAA则诱导了愈伤组织的产生，不利于茎段的增殖和生长，这与前人关于同属树种组培的研究相符［8－11］。

不定根的发生与基因型和培养条件密切相关，该试验选用越橘品种‘比洛克西’，生根最适培养基为WPM+IBA 0.2 mg/L，生根率为63.3%。不同品种试管苗的生根表现还有待进一步研究。试管苗移栽成活率的高低除与苗的健壮程度有关外，还与移栽基质、环境温度及移栽后的栽培管理有关。该试验初步设置了泥炭土为栽培基质，今后还将对栽培基质配方和移栽驯化条件进行更深入的研究，以期提高试管苗的移栽成活率。

图1 越橘‘比洛克西’的组培快繁

［1］苑兆和.世界蓝莓生产历史与发展趋势［J］.落叶果树，2003，20(1):49－52.

［2］刘庆忠，赵红军.越桔高效栽培与加工利用［M］.北京:中国农业出版社，2003:64－71.

［3］段祖安，李建华，赵艳燕，等.越橘离体快繁体系的优化［J］.南京林业大学学报(自然科学版)，2010，34(3):168 －170.

［4］刘庆忠，赵红军.高灌蓝莓的组织培养及快速繁殖［J］.植物生理学通讯，2002，38(3):253 －253.

［5］张长青，李广平，朱士农，等.兔眼越橘茎段快繁高效技术研究［J］.果树学报，2007，24(6):837－840.

［6］朱宏芬，沈岚，黄坚，等.兔眼蓝莓“灿烂”组织培养与植株再生研究［J］.北方园艺，2012，39(19):105 －107.

［7］李丽容，金开正.兔眼蓝莓组培快繁试验［J］.中国南方果树，2010，39(1):71－72.

［8］王新苗，杨磊，张海林.矮丛蓝莓叶片愈伤组织培养的研究［J］.绿色科技，2010，1(10):185 －188.

［9］邢瑞丹，刘庆忠，陈新，等.两个蓝莓品种离体叶片不定芽再生体系的建立［J］.山东农业科学，2009，47(5):8 －11.

［10］张力思，魏海蓉，艾呈祥，等.培养基组分对蓝莓组培增殖效率的影响［J］.落叶果树，2006，38(4):13 －14.

［11］宁志怨，江芹，陈静娴，等.蓝莓丛生芽的诱导及植株再生［J］.分子植物育种，2007，5(Z1):64 －66.

［12］龚峥，张卫华，张方秋，等.绵毛银桦的组织培养与快速繁殖［J］.广东农业科学，2014，50(2):57 －60.

［13］韩晓勇，闫瑞霞，殷剑美，等.铁棍山药组织培养快繁及试管珠芽离体再生体系研究［J］.西北植物学报，2013，33(10):2120－2125.