加味四君子汤干预脾气虚肺癌survivin基因研究

包素珍，李恒楠

（浙江中医药大学，浙江杭州310053）

病证结合，实质是将疾病体系与证候体系相结合，研究疾病的发生发展规律，揭示中医学基础理论的科学内涵，指导疾病防治。我们研究脾气虚肺癌，其理论根源于肺脾的相关性，如《素问·经脉别论》云“饮食入胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺”，肺所宣发肃降的精微物质来源于脾所升清上散之水谷精气，即所谓“土生金”。在临床上，本研究团队发现肺癌患者常见脾气虚证型。本研究即在以上研究基础上，建立脾气虚动物模型，接种肺癌瘤株，运用加味四君子汤进行干预，再结合分子生物学RT-PCR技术检测survivin mRNA的表达，从病-证-方结合探讨脾气虚肺癌，以期探索脾气虚对肺癌的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及瘤株 C57BL/6雌性小鼠70只，体重（18±2）g，浙江中医药大学实验动物中心提供；小鼠Lewis肺癌瘤株，浙江中医药大学实验动物中心提供。1.1.2 实验药物 加味四君子汤组成：生黄芪30 g，制半夏12 g，浙贝母12 g，白花蛇舌草30 g，茯苓15 g，炒白术20 g，党参15 g，炙甘草10 g。方中所有药物均购自浙江中医药大学中医门诊部。按照《中药药理研究方法学》计算小鼠的等效剂量，配制成含生药浓度为1 g/mL的煎液。大黄粉300 g，药物购自浙江中医药大学门诊部中药房。水浴：300 g大黄粉加水1800 mL，50℃水浴锅里放置4 h，每小时搅拌1次，水浴出1200 mL大黄液，而后负压旋蒸仪设定50℃浓缩成300 mL大黄液，浓度为1 g/mL，4℃冰箱保存备用。1.1.3 试剂与仪器 D-木糖测试盒（批号：20130725），南京建成生物工程研究所；TNF-α ELISA试剂盒（批号：E2013072508），杭州诚维生物科技有限公司；RNAiso Plus RNA 提取试剂（lot：AK7504），SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ（lot：AK3702），PrimeScriptTMRT Master Mix（LOT：AK 2402），宝生物工程（大连）有限公司；survivin，gapdh引物，上海生工生物工程技术服务有限公司。RF-PCR引物序列、碱基数见表1。

表1 RT-PCR引物的序列、碱基数

1.2 实验方法

1.2.1 分组及造模 随机取30只小鼠正常饲养，其余40只采用苦寒泻下法、强制游泳及禁食的方法制备脾气虚模型。当动物出现食量减少，成群蜷缩，嗜卧，懒动，四肢抵抗力减弱，反应迟钝，行动缓慢，提示造模成功。脾气虚模型成功后给正常组10只和脾气虚模型组20只小鼠的左腋下接种Lewis肺癌瘤株，小鼠于接种后第5~7天腋下出现米粒大小的肿块，提示小鼠脾气虚证Lewis肺癌模型成功。将小鼠分为正常组、脾气虚自复组、肺癌组、脾气虚肺癌组、脾气虚肺癌治疗组。脾气虚肺癌治疗组用中药加味四君子汤灌胃每日1次，每次0.4 mL/20 g；其余各组以相同剂量的生理盐水灌胃，每日1次，各组均连续给药14 d。

1.2.2 指标检测 给药14 d后禁食不禁水12 h，第15天脱颈椎处死小鼠。开胸取肺称重后冻于液氮中，复苏加生理盐水研磨，取肺组织匀浆上清液，用于ELISA检测细胞因子TNF-α的表达。剖离肿瘤组织，称重后冻于液氮中，用于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测survivin mRNA的表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示；计量资料两组间比较用t检验，多组间比较用单因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脾气虚对小鼠肺癌瘤重的影响

与肺癌组比较，脾气虚肺癌组肺癌瘤体质量明显增加（P<0.01）。结果见表2。

表2 各组小鼠肺癌瘤体质量比较 （±s）

表2 各组小鼠肺癌瘤体质量比较 （±s）

注：与肺癌组比较，1）P<0.01

组别肺癌组脾气虚肺癌组脾气虚肺癌治疗组瘤体质量（g）3.2388±0.626064.1013±0.663931）3.4150±0.69339

2.2 脾气虚对小鼠肺组织中细胞因子TNF-α的影响

结果见表3。

表3 脾气虚对小鼠肺组织TNF-α水平的影响 （±s）

表3 脾气虚对小鼠肺组织TNF-α水平的影响 （±s）

注：与正常组比较，1）P<0.01

组别正常组脾气虚组TNF-α（pg/mL）726.3772±60.7936645.7284±31.57561）

由表3可以看出，脾气虚组小鼠肺组织中TNF-α的含量明显低于正常组（P<0.01）。

2.3 加味四君子汤对脾气虚证小鼠肺癌组织中survivin mRNA表达的影响

结果见表4。

表4 各组小鼠survivin mRNA水平比较 （±s）

表4 各组小鼠survivin mRNA水平比较 （±s）

注：与肺癌组比较，1）P<0.01；与脾气虚肺癌组比较，2）P<0.01

组别肺癌组脾气虚肺癌组脾气虚肺癌治疗组survivin基因1.0836±0.45461.9732±0.27381）1.2400±0.45772）

由表4可见，与肺癌组比较，脾气虚肺癌组survivin mRNA水平显著升高（P<0.01）；脾气虚肺癌治疗组较脾气虚肺癌组survivin mRNA水平明显降低（P<0.01）。

3 讨 论

脾气虚肺癌模型成功后，课题组将经典健脾益气方四君子汤进行加味。因肺癌病人常见疲倦乏力，重加黄芪，增加补气力量；因脾虚又易生痰，加半夏、贝母，断其来路，截其去路；加白花蛇舌草，解毒抗癌。本方依循中医“先救人，后治病”原则以补脾气为主，兼以化痰、抗癌，适合素禀脾气虚又患肺癌患者，或肺癌患者化疗后出现呕吐、泄泻者。

结果显示，脾气虚肺癌组瘤体质量较肺癌组显著增加（P<0.01），说明脾气虚对肺癌增长有一定影响。加味四君子汤干预脾气虚肺癌小鼠后，肺癌瘤体质量减小，从方证结合的角度证明了模型的成功，也证明了中药的有效性。

survivin是迄今克隆出的最小的IAP，对细胞凋亡、细胞周期均有调控作用，被认为是维持细胞增殖和凋亡平衡的界面分子［1］。正常情况下survivin仅表达于胚胎和发育的胎儿组织，而不表达于成人终末分化组织，病理情况下其表达于大多数恶性肿瘤，提示survivin在肿瘤的发生中可能具有重要作用［2-3］。经多人研究证实，survivin高表达于非小细胞肺癌组织，并且和预后密切相关［4-7］。本课题运用RT-PCR检测了肺癌组、脾气虚肺癌组、脾气虚肺癌治疗组3组肿瘤组织的survivin mRNA表达，发现肺癌组与脾气虚肺癌组相比，差异有统计学意义（P<0.01），说明在脾气虚证的肺癌survivin更易表达；脾气虚肺癌组与脾气虚肺癌治疗组相比，差异有统计学意义（P<0.01），由此推测加味四君子汤对脾气虚肺癌的治疗作用机制可能与下调survivin基因表达有关。

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