血液制品中人细小病毒B19基因的检测与分析

郑荣斌　余燕

[摘要] 目的 检测血液制品及原料血浆中人细小病毒B19，分析污染状况，以评估人细小病毒B19危险性。 方法 对单人原料血浆、混合原料血浆、4种类型的血液制品提取核酸后分别进行B19病毒核酸实时定量PCR检测筛查，对筛查结果进行数据统计分析。 结果 实验检测到个人血浆阳性率为0.267%、混合血浆感染5.45%、静注人免疫球蛋白感染0、人纤维蛋白原感染5.67%、人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物阳性率分别为7.41%和10.3%。 结论 尽管国内在血液制品生产工艺中使用了灭活/去除B19病毒的方法，但在本研究中筛查的原料血浆及血液制品中仍检测出了B19 DNA。

[关键词] 血液制品；原料血浆；人细小病毒B19基因；荧光定量PCR

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）13-151-03

[Abstract] Objective To test human bocavirus B19 in blood products and source plasma， and evaluate the danger of human bocavirus B19 by analyzing its contamination status. Methods Real-time quantitative PCR testing and screening of B19 nucleic acid was made after extracting nucleic acid from single source plasma， mixed source plasma and four types' blood products， and the screening results were statistically analyzed. Results The results were tested in laboratory including 0.267% positive rate of single plasma， 5.15% of contamination in mixed plasma， 0 of contamination in intravenous injection of human immunoglobulin， 5.67% of contamination in human fibrinogen， 7.41% positive rate of human coagulation factor Ⅷ and 10.3% positive rate of human prothrombin complex. Conclusion Although the methods to inactivate or eliminate B19 virus in production process of blood products， B19 DNA is still tested in the screening source plasma and blood products in this research.

[Key words] Blood products； Source plasma； Human bocavirus B19 gene； Fluorescence quantitative PCR

近年来，血液制品在某些特定疾病的治疗起着不可替代的作用，伴随着血液制品越来越受到广大患者的需求的同时，一些具有潜在危害的病毒渐渐引起人们的关注，这其中人细小病毒对长期输注血液制品的患者所引发的安全性危害问题更加受到国际社会的密切关注。人细小病毒B19（Human Parvovirus B19）是目前已知导致人类致病的细小病毒之一。临床表现为传染性红斑、短暂的关节炎疼痛、因慢性骨髓障碍导致慢性贫血等多种疾病[1-3]。人细小病毒B19由于其病毒颗粒直径仅20～25nm、无膜包被的生物学特性使其很难在病毒灭活工艺中除去，并且它能够抵抗多种生产中使用的病毒灭活方法，包括S/D法[4]、高温灭活法。目前已有资料证明B19可经由S/D法和一定干热灭活法处理的血液制品传播[5-7]。因此，对血液制品的检测、筛查及B19筛查方法的建立对保护患者

的健康至关重要。本次实验拟采用B19核酸检测试剂盒，对华南地区的原料血浆和血液制品随机采样进行了检测和分析，为进一步了解华南地区的血液制品 B19病毒的感染和污染情况提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取2013年12月～2014年12月华南地区（以广东省为主）的2家血液制品公司的血液制品（包含人凝血因子Ⅷ54批、人纤维蛋白原53批、人凝血酶原复合物58批、静注人免疫球蛋白55批），在血液中心采取6000份个体血浆，在随机抽取的2家血液制品公司生产用混合血浆65份[样本的采集、运输及保存均符合《中国药典》三部（2010版）生产用人血浆规程要求]。

1.2 试剂与仪器

实验采用试剂盒法对采取的样品进行小病毒核酸的提取。

主要仪器：美国ABI公司的PCR仪；VeritiTM96 Well Thermal Cycler，荧光定量PCR扩增仪：7300 Real-Time PCR System，紫外-可见分光光度计（GE，GeneQuant1300），恒温水浴箱、生物安全柜、高速离心机及高速冷冻离心机。

试剂盒：Nucleus Acid Isolation Kit（Spin Column Method）、人细小病毒B19病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法），均购自上海科华生物工程股份有限公司。Premix Ex Taq TM（2x）购自TaKaRa公司。endprint

1.3 实验方法

1.3.1 PCR引物探针 根据相关文献报道的关于人细小病毒B19 DNA 的TaqMan探针及对应的引物 [8]。用Primer Premie 5.0软件对此探针和引物序列进行评价。见表1。

1.3.2 细小病毒DNA的提取 血浆样品用1.5mlEP管标记后每份提取200μL，加入200μL缓冲液（现配）使用上海科华生物工程股份有限公司核酸提取试剂盒，在经过78℃恒温处理及分别经过8000、12000rpm/min离心处理后，最终获得每份DNA为50μL，样品在-30℃保存备用。血液制品各类样品进行浓缩后，同血浆样品提取方法最终获得50μL/份，-30℃保存备用。

1.3.3 实时定量PCR反应体系和反应条件 经多次实验及参考厂家人细小病毒B19病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书，最终确定反应体系为PCR扩增体系50μL：Premix Ex Taq TM（2x）25μL，引物各1μL（10mmol/L），探针1μL（10mmol/L）DNA模板2μL。反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，53℃退火30s，68℃延伸30s，共45个循环；68℃延伸10min。

1.3.4 细小病毒DNA的检测 在经过对每份血浆及其制品的DNA提取之后，每份核酸样品使用实时定量PCR扩增检测，每个样品设三个复孔检测，阳性对照为上海科华生物工程股份有限公司人细小病毒B19病毒核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）中自带阳性对照，同时设无模板阴性对照（NTC）。

1.4 判定标准

阴性结果判定：荧光信号无增长，没有典型S型扩增曲线；阳性结果判定：荧光信号增长明显，典型的S型扩增曲线。

2 结果

2.1 单人份血浆检测结果

在血液中心随机抽取的6000份个体血浆样中，用荧光PCR技术检测B19 DNA，检出阳性16份。

2.2 混合血浆检测结果

在2家血液制品公司中随机抽取的165份生产用混合血浆中，共检出阳性9份。

2.3 血液制品检测结果

随机抽取的55批静注人免疫球蛋白样品，B19病毒DNA 检测结果均为阴性；在抽取的53批的人纤维蛋白原样品中，有3批为阳性；在54批次的人凝血因子Ⅷ样品中，结果4批检测为阳性；抽取58批次的人凝血酶原复合物样品中，检测出6次为阳性。见表2。

3 讨论

目前，我国也无对血液制品人细小病毒的强制检测规定。目前在国外已有B19 DNA污染血液制品的报道，然而B19 DNA在中国血液制品中的污染情况尚没有展幵广泛调查。本次实验通过对华南地区血液制品的检测筛查，统计数据，使得人们更加直观的了解到目前国内血液制品所存在的安全性问题。

血液制品在当今临床医疗急救中起到了不可替代的作用。然而，随着血液制品的推广使用，至今也时有血液病传染的发生[9-11]。虽然现阶段的采集血样均经过筛查、工艺消毒及逐步检查管理，已经大幅度的降低了病毒的感染，保证血液制品使用的安全性[12]。传统的去除/灭活病毒工艺对包膜病毒（如HIV、HBV和HCV）是十分有效的，但不能去除/灭活非包膜病毒（如B19），因此B19污染血液制品的潜在风险仍然存在。原因有以下几点：（1）原料血衆均为超过5000份/批次的混装，存在很大的B19污染风险，更严重的是，在病毒血症期，B19在感染者体内浓度可达1010copies/mL以上。（2）B19病毒由于其耐热性以及病毒颗粒微小的特性极易逃脱传统病毒的去除/灭活（如热处理法和过滤法）处[13-16]。（3）B19此类微小病毒具有耐热性强、穿透性强的特点，在已知的过滤法及热处理法中都不能有效去除该类病毒，为血液制品的使用安全流下隐患。

本研究采用实时荧光定量PCR法对采集的样品进行了针对B19病毒DNA的筛查，实验方法未能检出静注人免疫球蛋白样品阳性，个人血浆感染率为0.267%，而混合血浆及血液制品的阳性污染达到了很高的概率。查阅国内外文献报道记载的混合血浆感染率略高于本次调查，这可能与地域有关。查阅美国文献[17]报道原料血浆在经过荧光定量PCR检测的血液制品中人细小病毒B19的感染率从原来的56%～100%降至13%～27%，说明光定量PCR检测方式可以起到一定的效果。

目前，国内尚无明确检查B19病毒核酸的方法，国内在B19病毒方面的分布状况研究尚不系统。因此针对国内数据缺乏足够的基础理论。通过对华南地区血液制品进行B19病毒核酸的检测与分析，不仅可以分析目前国内血液制品细小病毒的安全问题，也可为今后的制定B19病毒核酸的筛查方式提供理论基础。

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（收稿日期：2015-03-19）endprint