耳草提取物的抑菌作用及急性毒性研究

朱智德，罗宇东，刘源焕，李　娜

（广西中医药大学制药厂，广西　南宁　530023）

耳草提取物的抑菌作用及急性毒性研究

朱智德，罗宇东，刘源焕，李娜

（广西中医药大学制药厂，广西南宁530023）

［目的］研究耳草提取物的抑菌作用及急性毒性。［方法］运用琼脂平板结合试管二倍稀释法观察耳草提取物（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇、水提取物）对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等的抑制作用；急性毒性试验采用小鼠灌胃法，测定耳草水提取物、乙醇提取物的最大给药量。［结果］体外抑菌试验表明，耳草水、乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌均有不同程度的抑制作用；系统溶剂提取物中，乙酸乙酯、正丁醇、甲醇提取物具有抑制大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌的作用，而氯仿、石油醚提取物抑菌作用不明显。急性毒性试验表明耳草水提取物、乙醇提取物的最大给药量为252.4 g/kg、336.6 g/kg。［结论］耳草提取物具有抑菌作用，水提取物及乙醇提取物的急性毒性很小。

耳草；提取物；抑菌作用；急性毒性

耳草为茜草科植物耳草Hedyotis hedyotidea（Dc.）Merr.的全草，别名较剪草、鲫鱼胆草、细叶亚婆巢、节节花等，具有散瘀消肿、清热解毒之效，对感冒发热、咽喉痛、咳嗽、肠炎、痢疾、疮疖和蛇咬伤均有较好的疗效。耳草产于我国南部和西南部各省区，为广西少数民族（壮瑶）地区民间广泛使用的药材。文献报道耳草具有抗炎、镇痛等作用［1-5］。本文对其抑菌作用及急性毒性进行研究，为耳草的进一步开发提供理论指导。

1　实验材料

1.1动物昆明系小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，购自广西医科大学实验动物中心，清洁级，合格证号：SCXK桂2014-0002。

1.2菌株、菌液铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）由南宁市第四人民医院微生物室提供，金黄色葡萄球菌（Staphy lococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、沙门菌（Salmonella）均购自中国药品生物制品检定研究院，菌种批号分别为：26003-5a23-2、44102-3a14、50094-1a5。营养肉汤培养基（北京陆桥技术有限责任公司生产，批号：140819）；营养琼脂培养基（北京三药科技开发公司生产，批号：140806）。菌液制备：挑取以上菌株的菌落，接种于肉汤培养管中，37℃培养24 h后，用生理盐水稀释为106CFU/ml的试验菌液备用。

1.3试药耳草采自广西上林县，经广西中医药大学中药鉴定教研室鉴定为茜草科耳草属植物耳草Hedyotis hedyotidea （DC.）Merr.的干燥藤茎。

1.4主要试剂及仪器JY501电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；101-1恒温电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；RE501旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；XFS-280压力蒸汽灭菌器（浙江新丰医疗器械有限公司）；LRH-250生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SW-CJ-2D超净工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

2　方法与结果

2.1耳草提取物的制备

2.1.1耳草水提物（A）药材粉碎，加水煎煮3次，每次1 h，过滤，滤液浓缩至浸膏（A），每克浸膏相当于药材量2.5 g，批号：20131201。

2.1.2耳草乙醇提取物（B） 耳草粉碎成细粉（100目），加入75%乙醇回流提取2次（每次8倍量，2 h），提取液抽滤，挥去乙醇，蒸干得浸膏（B），每克浸膏相当于原药材2.0 g，批号：20131202。

2.1.3耳草系统溶剂提取物（C～G）药材粉碎（100目），按系统溶剂提取法分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇回流提取，提取液滤过，蒸干得稠膏。石油醚（G）、氯仿（F）、乙酸乙酯（E）、正丁醇（D）、甲醇（C）提取物相当的药材量分别为750，210，350，70，15 g/g（稠膏/药材）。

上述提取物均由广西中医药大学制药厂制备，实验时配制成所需浓度。

2.2抑菌作用试验［6-9］取1 ml小试管若干支，将耳草不同溶剂提取物（A～G）分别按试管稀释法等倍稀释（1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128），制备得系列浓度为90，45，22.5，11.3，5.6，2.8，1.4 mg/ml的供试液，每支试管中接种相应的试验菌液各50 μl，混合均匀，置37℃培养24 h，然后再从每一支试管中取10 μl培养物转种于营养琼脂平板上，均匀涂布，培养24 h（37℃），观察各平板上细菌的生长情况，以此计算药物的最小抑菌浓度（MIC）。药物的最小抑菌浓度指不生长菌落的最高药物稀释度。平行试验3次，以2次或者3次结果相同为有效。结果见表1、表2。

表1　耳草水、乙醇提取物对各菌株的MIC测定结果　（mg/ml）

表2　耳草系统溶剂提取物对各菌株的MIC测定结果　（mg/ml）

由表1可见，耳草水提物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌的MIC分别为2.8，5.6，45，45 mg/ml；耳草乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌的MIC分别为5.6，2.8，45，45 mg/ml。可见耳草乙醇、水提取物对上述受试细菌有一定的抑制作用。

由表2可见，耳草不同极性溶剂的提取物中，甲醇提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌的MIC分别为5.6，2.8，11.3，11.3 mg/ml；正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌的MIC分别为5.6，11.3，45，22.5 mg/ml；乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌的MIC分别为11.3，11.3，45，22.5 mg/ml；可见耳草的甲醇、正丁醇、乙酸乙酯提取物对上述受试细菌均有抑制作用。石油醚、氯仿提取物则对上述受试细菌无抑制效果。2.3耳草急性毒性试验［10-11］取60只小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为3组，即空白对照组、耳草水提组、耳草醇提组，每组20只小鼠。小鼠禁饲（供水）20 h后，以耳草水提物最大浓度（2.5 g/ml）、醇提物最大浓度（3.7 g/ml）分别灌胃给予受试药液，一天灌胃2次（上午8时和下午3时，给药体积均为40 ml/kg，空白对照组灌胃等量饮用水，观察给药后14天内小鼠的体重、外观、行为、呼吸、四肢活动、进食、排泄、死亡等情况。14天后解剖小鼠，观察组织脏器有无异常改变。

结果显示，给药后14天内小鼠的外观、行为、呼吸、四肢活动、进食、排泄等均未见明显异常，无死亡现象；给药组与空白对照组小鼠体质量比较无显著性差异。14天后解剖小鼠，观察主要组织脏器，给药组与空白对照组比较，动物均无异常现象。测定耳草水提取物、乙醇提取物的最大给药量为252.4 g/kg、336.6 g/kg，提示耳草的急性毒性很小。结果见表3。

表3　耳草对小鼠急性毒性试验体质量的影响　（±s）

表3　耳草对小鼠急性毒性试验体质量的影响　（±s）

组 别　n　给药浓度（g/ml）　给药量（ml/kg）　给药前体质量（g） 给药14天体质量（g）　增长率（%）空白对照组　20　—　40　20.15±1.12　28.60±1.70　41.93耳草水提组　20　2.5　40　20.21±1.08　29.15±1.80　44.24耳草醇提组　20　3.7　40　20.05±1.06　29.50±2.05　47.13

3　讨论

3.1耳草在两广地区广泛应用，是岭南著名的抗炎镇痛和伤科用药。国内对耳草的药理研究已经取得了一定的进展，表明其具有抗炎镇痛等作用，但对其抑菌作用及急性毒性研究方面的报道却很少，为此本文开展了耳草抑菌作用及急性毒性试验研究。体外抑菌试验表明，耳草水、乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌均有不同程度的抑制作用；系统溶剂提取物中，乙酸乙酯、正丁醇、甲醇提取物具有抑制大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌的作用，而氯仿、石油醚提取物抑菌作用不明显。急性毒性试验结果表明，耳草水提取物、乙醇提取物的最大给药量为252.4 g/kg、336.6 g/kg，提示耳草的毒性很低。

3.2国内报道耳草含有β-谷甾醇、莨菪亭、表白桦脂酸、羽扁豆醇、齐墩果酸、咖啡酸、挥发油等成分［1-5］。本研究表明耳草提取物体外试验具有一定的抑菌效果，但考虑到中药材的体内及体外抑菌作用差别较大，耳草是否具有体内抑菌作用还有待进一步的研究。

［1］陶曙红，陈艳芬，李钟，等.耳草抗炎活性化学成分的研究［J］.广东药学院学报，2011，27（4）：364-366.

［2］陈艳芬，陶曙，余结贞，等.耳草抗炎镇痛作用有效部位的筛选［J］.中药新药与临床药理，2012，23（1）：17-19.

［3］陶曙红，张少逵，袁旭江.耳草叶挥发油化学成分的GCMS分析［J］.中成药，2010，32（3）：511-512.

［4］禹建春，霍敏，方贺斌，等.耳草的鉴别研究［J］.海峡药学，2012，24（11）：55-56.

［5］梁洁莹，李书渊.耳草的生药学研究［J］.广东药学院学报，2008，24（5）：447-448.

［6］陈奇.中药药理研究方法学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2006：244.

［7］秦海宏，贾琳钰，阎建义，等.凤仙花水提物体外和体内的抑菌活性［J］.吉林大学学报：医学版，2013，39（1）：60-63.

［8］武新华，马秀敏，丁剑冰，等.新疆赤芍抑菌实验研究［J］.中国民族医药杂志，2005，11（5）：30-31.

［9］张宏，甘雨，乔敏，等.射干提取物抑菌实验研究［J］.实验动物科学，2012，29（2）：5-7.

［10］农毅清，蒋林，吴玉强，等.常春卫矛与爬行卫矛的镇痛抗炎作用及急性毒性研究［J］.时珍国医国药，2012，23 （6）：1384-1385.

［11］周智，韦奇志，吴植强，等.扶芳藤一般药理及急性毒性研究［J］.中国药师，2011，14（8）：1115-1117.

（编辑陈明伟）

R285.5

A

2095-4441（2015）03-0052-03

2015-08-01

广西卫生厅中医药科技专项课题（编号：GZZY13-14）

朱智德，博士研究生，副教授，研究方向：药品、食品研究开发

罗宇东，E-mail：1097201466@qq.com