化橘红中主要活性成分对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响

董晶，肖移生，陈海芳，罗小泉，黄佩蓓，裴 昆，易徐航，杨武亮



化橘红中主要活性成分对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响

董晶1，肖移生2，陈海芳1，罗小泉1，黄佩蓓2，裴 昆1，易徐航1，*杨武亮1

（1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西，南昌330004；2.江西中医药大学基础医学院，江西，南昌330004）

目的 初步观察化橘红中主要活性成分对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响。方法 通过原代培养豚鼠气管平滑肌细胞，采用MTT法观察化橘红中主要活性成分柚皮苷（Naringin）、橘皮内酯（Meranzin）和水合橘皮内酯（Meranzin hydrate）对细胞增殖的影响。结果 柚皮苷（0.2 ~2.0 mg/mL）对豚鼠气管平滑肌细胞增殖有明显的促进作用（< 0.01），水合橘皮内酯（0.1 ~1.0 mg/mL）对豚鼠气管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用（< 0.01），橘皮内酯（0.05 ~ 0.5 mg/mL）对豚鼠气管平滑肌细胞的增殖作用不明显（＞0.05）。结论 柚皮苷与水合橘皮内酯可能是化橘红主要药效活性成分。

化橘红；活性成分；豚鼠支气管平滑肌细胞；细胞增殖

化橘红为芸香科植物化州柚或柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，具有理气宽中、燥湿化痰的功效，用于咳嗽痰多、食积伤酒、呕恶痞闷[1]。化橘红因其常单味入药，其药效研究目前多集中在总提取物[2]、化橘红总黄酮[3-4]及多糖部位[5-9]。实验大多采用小鼠、大鼠的酚红排泌量法[9-10]，或小鼠氨水、豚鼠枸橼酸引咳实验[9-10]，以及采用豚鼠离体平滑肌[2]等研究方法，以观察与化橘红中医临床功效主治相吻合的药效部位或活性成分。但化橘红中各主要化学成分的药效作用仍不明，且对其所含主要成分药效观察少见报道。本研究拟采用MTT法观察化橘红中主要活性成分柚皮苷、橘皮内酯和水合橘皮内酯对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响，为下一步找寻化橘红中的药效物质基础提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

化橘红主要单体成分（柚皮苷、橘皮内酯、水合橘皮内酯）均自制（纯度> 98%）；DMEM培养基（Solarbio公司，批号：20140326）；四甲基偶氮唑盐MTT（Solarbio公司）；青链霉素混合液（100X）（Solarbio公司，批号：20131218）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）（Solarbio公司，批号：20120725）；D-Hanks平衡盐粉剂（无酚红）（Leagene，批号：0425A14）；无支原体胎牛血清（FBS，四季青，批号：120716）；二甲基亚砜（DMSO，天津福晨化学试剂，批号：20120712）。

1.2 主要仪器

洁净工作台（苏洁净化，100级）、显微镜（XDS-1B）、离心机H-1650、细胞培养箱（SANYO MCO-175）、手术器械一套、酶标仪（BioTek ELx800，Gene Company Limited）。

1.3 动物

豚鼠(上海生旺实验动物养殖有限公司)，150 g ± 50 g，雌雄兼有，生产许可证号：SCXK（沪）2012-0007。

1.4 方法

1.4.1 豚鼠气管平滑肌的获取与培养[11]

原代培养：取幼年豚鼠，木棒猛击头部致晕，75％乙醇浸洗全身，无菌条件下剪开颈部，取出自气管隆突至支气管分叉处的一段气管。D-Hanks液漂洗3遍，纵行剪开气管，剥离上皮、结缔组织、血管后，移入另一加有少量DMEM(含15％FBS)的培养皿中，用虹膜剪将气管剪成1 mm3的小块。将组织块移入培养瓶(50 mL)中，阵状排列，使其均匀分布于培养瓶底部，并将培养瓶倒置轻放于37℃、5％CO2培养箱中。16～18 h后当组织块边缘轻微干涸而粘牢于瓶壁时，沿培养瓶颈缓缓滴入3 mL含15％FBS的DMEM培养基，使组织块完全浸泡于培养基，置培养箱内继续培养。每3d换液1次，5~8 d后可见细胞自组织块周围长出，两周后细胞长满瓶壁，呈辐射状向四周生长，细胞多成梭形或长菱形，组织块周围细胞密度增大，呈现“峰—谷”状。

传代培养：两周后培养的气管平滑肌细胞融合，局部叠加生长密度较大，这时需进行传代培养。D-Hanks液漂洗2遍，再加入胰蛋白酶-EDTA消化液覆盖整个细胞培养面，作用1 min后在倒置显微镜下观察，细胞胞质回缩、胞间间隙增大时终止消化。迅速吸出消化液，加入含15％FBS的DMEM培养液，用吸管反复轻轻吹打瓶壁，使贴壁细胞悬浮。收集细胞悬液于经灭菌的离心管中，1000 r/min离心5 min，弃去上清液，向沉淀中加入10~15 mL含15％FBS的DMEM培养液，以1:2的比例接种于新的培养瓶中，每3 d换液1次，待细胞长满瓶底的80％时继续传代。

1.4.2 MTT法测定[12-13]

实验分别设调零孔、对照孔、加药孔。测量时将配置好的MTT溶液(5 mg/mL)，每孔10 μL加入96孔板，避光操作，于培养箱中37℃孵育4 h后出现蓝色晶体，移液枪弃去每孔液体后加入100 μL DMSO，摇床5 min至蓝色晶体全部溶解，酶标仪490 nm处测量各孔的OD值。因活性细胞的数量与490 nm处的OD值成正比，所以计算豚鼠气管平滑肌细胞的增殖率：

1.4.3 给药方案

配制各单体成分（柚皮苷、橘皮内酯、水合橘皮内酯）的母液，过滤除菌，临用前用含15%胎牛血清的DMEM培养液稀释成不同浓度的供试液。每组分别设调零组（培养液+助溶剂DMSO）、对照组（细胞悬液+培养液+DMSO）以及给药各浓度组。以1×105个/mL的密度接种细胞板，每组设6个复孔，每组平行实验3次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件，采用单因素方差分析，计量资料以均数± 标准差表示（）。

2 实验结果

本实验对化橘红中主要单体成分柚皮苷、橘皮内酯、水合橘皮内酯对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响进行了考察，通过MTT法比较各实验组与对照组的差异性，并计算各实验组细胞增殖的增殖率，其结果见表1~表3。

表1 柚皮苷对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响

注：与对照组比较**< 0.01

表2水合橘皮内酯对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响

Table 2 Effect of Meranzin hydrate on guinea pig tracheal smooth muscle cells proliferation

注：与对照组比较**< 0.01

表3 橘皮内酯对豚鼠气管平滑肌细胞增殖的影响

3 讨论

化橘红是中医临床常用中药，具有理气宽中、燥湿化痰的功效，且常单味入药，其主要含有柚皮苷、水合橘皮内酯、橘皮内酯和多糖等成分，其与中医临床功效主治相吻合的活性成分及其药效作用机制有待进一步考察。

上述实验结果显示：柚皮苷(0.2 ~2 mg/mL)对豚鼠气管平滑肌细胞增殖有明显的促进作用(< 0.01)；水合橘皮内酯(0.1 ~1 mg/mL)对细胞增殖有明显的抑制作用(< 0.01)；橘皮内酯(0.05 ~0.5 mg/mL)对细胞增殖作用不明显(> 0.05)。实验数据初步表明柚皮苷与水合橘皮内酯可能是化橘红化痰作用的活性成分，可为下一步动物离体组织试验和在体试验提供依据。

本实验采用豚鼠气管平滑肌组织块原代培养方法，与酶消化原代培养的方法[14-15]相比，仅需加入胰蛋白酶，不需添加胶原酶、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白等，因而此法简便而经济。

参考文献：

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Effects of the main active components in Exocarpium on the proliferation of tracheal smooth muscle cells in guinea pig

DONG Jing1, XIAO Yi-sheng2, CHEN Hai-fang1, LUO Xiao-quan1, HUANG Pei-bei2, PEI Kun1, YI Xu-hang1,*YANG Wu-liang1

(1. Key Laboratory of Modern Preparation of TCM of Ministry of Education, Jiangxi University of TCM, Nanchang, Jiangxi 330004, China;2.Preclinical Medicine College, Jiangxi University of TCM, Nanchang, Jiangxi 330004, China)

Objective: To research the effects of active components in exocarpium onthe proliferation of tracheal smooth muscle cells in guinea pig.Methods: Primary cell culture and the effects of active components Naringin, Meranzin and Meranzin hydrate in exocarpium on cell proliferation were determined by MTT method. Results: The results showed that Naringin had a remarkable promotive effect on the proliferation of tracheal smooth muscle cells (0.2~2.0 mg/mL,< 0.01). Meranzin hydrate could inhibit the proliferation of cells (0.1~1.0 mg/mL,< 0.01). Meranzin affected cells non-significantly (0.05~0.5 mg/mL,＞ 0.05). Conclusion:Naringin and Meranzin hydrate were the active components in exocarpium.

exocarpium; active components; tracheal smooth muscle cells in guinea pig; cell proliferation

1674-8085(2015)01-0088-04

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.018

2014-10-10；修改日期：2014-12-15

国家自然科学基金项目(81460575，81260612)；江西省自然科学基金项目(20132BAB205092）；江西中医药大学江西省研究生创新项目(YC2014-S281)。

董 晶(1990-），女，山东德州人，硕士生，主要从事药物分析专业(E-mail:dj900304@163.com);

肖移生(1976-)，男，江西峡江人，讲师，硕士，主要从事中药抗衰老研究(E-mail:190892207@qq.com);

陈海芳(1979-)，女，浙江宁波人，讲师，博士，主要从事中药分析研究(E-mail:chenhf88@126.com);

罗小泉(1966-)，男，江西都昌人，教授，硕士，主要从事实验动物研究(E-mail:lxqdjl@126.com);

黄佩蓓(1964-)，女，江西高安人，教授，硕士生导师，主要从事分子生物学研究(E-mail：hppei@126.com);

裴 昆(1989-)，女，江西抚州人，硕士生，主要从事药物分析研究(E-mail: 814696659@qq.com);

易徐航(1990-)，男，江西萍乡人，硕士生，主要从事中药分析研究(E-mail: 280829830@ qq.com);

*杨武亮(1965-)，男，江西南昌人，教授，硕士生导师，主要从事中药质量控制及药效学研究(E-mail:yangwuliang@163.com).