脑卒中细胞治疗中诱导多功能干细胞的应用潜力

翁南川 詹仁雅

[摘要] 目的 诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）， 方法 主要是借助于诱导已分化的一种成熟体细胞异位，对某一个或者某一些基因进行表达，进而重新整编得到的一种多功能干细胞。结果 诱导多功能干细胞和胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）有着一定的相似度，不仅仅存在高度增值性，同时也存在多向分化潜能，可以分化成为神经元。结论 IPSCs具有无道德伦理障碍，无免疫排斥，取材方式简单、无创等优点，为脑卒中的细胞治疗提供了新的希望。现就近年来与iPSCs治疗脑卒中相关的研究作一综述。

[关键词] 脑卒中；诱导多功能干细胞；细胞治疗

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2015）09（a）-0098-03

Application Potential of Induced Pluripotent Stem Cells in Cell Therapy for Stroke

WENG Nan-chuan， ZHAN Ren-ya

Department of Neurosurgery， First Affiliated Hospital， Medical College of Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang Province， 310003 China

[Abstract] Objective To discuss the application potential of induced pluripotent stem cells （iPSCs） in cell therapy for stroke. Methods Under induction and reprogramming， differentiated adult cells can express one or some specific gene， thus changes into a kind of pluripotent stem cells， namely iPSCs. Results A certain degree of similarity can be found between iPSCs and embryonic stem cells stem （ESCs）， both of which have highly proliferative ability and multi-directional differentiation potential， for example， differentiation into neurons. Conclusion Without ethical problem and risk of immune rejection， iPSCs was simple to use and noninvasive， therefore it can offer hope for patients with stroke. This paper reviews the related research in recent years.

[Key words] Stroke Induced； Pluripotent stem cells for； Cell therapy

1 背景

脑卒中是造成人类死亡的三大疾病之一，在美国占人口死亡的第三位，在日本占第二位，在中国则占人口死亡的第一位。不仅脑卒中严重危害人类的健康，残疾的幸存者也给人类社会带来严重的经济负担。目前脑卒中的针对性治疗主要包括手术或介入处理异常血管、溶栓、传统的康复治疗等。然而，溶栓的治疗窗短：研究表明缺血性脑卒中发生后4.5 h内接受溶栓治疗的病例得到明显的临床效益，而在48 h内接受治疗的患者虽然得到一定效益，但是仍残留严重的神经功能缺陷，特别是脑卒中急性期即出现尿失禁、GCS评分高及神经功能缺损严重的患者。传统的康复治疗，包括电生理治疗，物理治疗等的治疗效果只能起到辅助作用。所以，一旦脑卒中发生，我们目前的治疗方法逆转神经功能缺陷悲惨结局的能力将十分有限。本文主要研究分析脑卒中细胞治疗中诱导多功能干细胞应用潜力时，结合诱导多功能干细胞的脑卒中细胞的治疗，并结合前人研究的现状，综述了关于脑卒中细胞治疗的最新研究进展，现报告如下：

2 脑卒中的细胞治疗

2.1 概况

干细胞与再生医学在人类疾病及外伤的治疗上正扮演着越来越重要的角色。脑卒中，由于其疾病过程中正常神经功能细胞的损害、丢失的特点，便是常见的细胞治疗的研究对象。胚胎干细胞（ESCs）、神经前体细胞（NPC）、工程细胞等已用于之前的研究，它们假设这些细胞通过各种方式到达脑卒中病灶后，能修复神经通路、促进血管新生、抑制炎症从而达到功能重建的目的。同时，这些细胞可能会分泌某些神经生长因子来促进神经的修复。越来越多的动物实验和临床前期研究出现，并证明了脑卒中细胞治疗的巨大潜力。

2.2 研究现状

迄今为止，有多种细胞已经用于脑卒中细胞治疗的研究，并得到正性结论。这些细胞可以分为三类：①来自胚胎组织的NPC；②体内尚未分化的NPC；③来自骨髓、脐带血或脂肪组织的ESCs。

研究表明NPC被移植到脑卒中病灶的实质后能生存、分化并改善神经功能 。hNT神经细胞来自于从一人畸胎得到的NT2细胞系，动物实验中，将其注入脑卒中模型的病灶里亦能改善模型的神经功能.另外，有报道称人体骨髓细胞、人体脐带血细胞、脂肪间充质干细胞均有改善脑卒中后神经功能恢复的作用。

hNT神经细胞是目前唯一被临床试验的人体细胞。在一临床I期试验研究中，12例基底节脑卒中的患者被选中，年龄在44～74岁，他们在加入试验前均存在稳定的神经运动功能的缺陷。在手术向脑卒中病灶注入hNT神经细胞后8周内，患者均接受免疫抑制治疗。结果其中6例患者的欧洲中风评分得到改善。在一临床II期试验中，18例存在稳定神经功能缺失1～6年的基底节脑卒中患者被分为两组，其中14位接受细胞治疗，另4位作为对照组。所有18例患者均同时接受传统的康复治疗。结果治疗组中6例患者在欧洲中风评分上得到明显改善，但是治疗组与对照组的欧洲中风评分不存在统计学上的差异。

2.3 存在的问题

关于脑卒中细胞治疗的研究，存在着许多问题：脑卒中模型的选定和制作；使用确切的预后评定标准；细胞来源的选定（人或动物来源，胚胎或成人来源，大脑或其他部位来源）；治疗窗的选定；治疗剂量、注射方式的选定；治疗并发症的预防等等[2]。理想的状况是能有一张标准的路线图，所有研究的设计都参考这张指南路线图，使得脑卒中的细胞治疗研究达到高效、安全、统一的目标。

3 iPSCs的起源和研究进展

2006年，2012年诺贝尔奖获得者Yamanaka首先利用逆转录病毒载体导入4种基因Oct3/4、Sox2、C-Myc和Klf4，通过将小鼠作为一种纤维细胞，并进行重新整编，产生和诱导多功能干细胞类似的一种多功能干细胞，这种多功能干细胞也即是iPSCs。但是伴随着成人上皮成纤维细胞逐渐的诱导，并将其诱导为一种iPSCs。人体细胞诱导的过程中，注重慢性病毒作为一种特殊的载体。熊杰[1]等在干细胞治疗神经退行性疾病的前景与问题中研究表明，诱导多功能干细胞逐渐成为全球范围干细胞的一种热点研究。

3.1 iPSCs的生物特性

所谓的iPSCs，刘文骏等[2]在导多功能干细胞治疗脊髓损伤的现状及思考中研究表明，借助于多能性标志分子Fbx15，在实际的表达过程中，结合一种转染后的细胞，在多层筛选之后，使得iPSCs不仅仅存在一定的多向分化潜能，细胞在细胞形态以及生长特性的研究过程中，表面标志物更是基于一种畸胎瘤的特点，和小鼠ESCs有着一定的相似度，在基因表达的过程中，基于一种DNA甲基化的形式，在嵌合体形成过程中，不同于一种小鼠ESCs。

邓君等[3]在诱导多功能干细胞在视网膜疾病中应用研究中表明，基于一种多能性标志分子，在分子的筛选过程中，不仅仅发现这种iPSCs实际的细胞形态有着不同，同时在生长特性和表面标志物的研究过程中，畸胎瘤往往和小鼠ESCs有着一定的相似性，基于一种DNA甲基化的方式，这种基因表达过程中，染色质的状态也有着一定的差异性。秦洁[4]在诱导多能干细胞来源的神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究中表明，基于人类成纤维细胞样滑模细胞的结构特点，这种源自新生儿的一种纤维细胞，在细胞系诱导过程中，结合iPSCs实际的细胞形态，在增值能力培养的过程中，做好表面抗原标志的合理应用，在基因表达谱以及多潜能干细胞特异性基因的实际表观过程中，基于一种遗传学的形态，这种端粒酶活性往往和人体的诱导多功能干细胞有着直接性的相似度，基于一种体外培养的过程中，小鼠体内的畸胎瘤，在实际的形成过程中，存在不同的胚层，同时也存在不同的细胞类型。

郭子宽[5]在间充质干细胞及其临床应用中的几个问题的研究中表明，诱导多功能干细胞往往和IPSCs存在一定的相似度，基于一种多能性的特点，做好多种成体细胞的综合性分化，在体外诱导的过程中，对功能的心肌细胞进行逐步的形成，在多种心血管细胞诱导的过程中，通过运动神经元细胞进行分化，同样也分化成一种神经胶质细胞。

方敏等[6]在干细胞移植治疗缺血性脑卒中的研究进展中分析表明，iPSCs对神经元细胞分化的过程中，基于一种神经胶质细胞，做好造血前体细胞的一种综合性的分化，在造血前体细胞不断的移植过程中，对于移植后的凝血功能有着根本上的改善过程。

3.2 iPSCs基础研究的最新进展

病毒逆转录是诱导iPSCs的主要方法，这种病毒在实际的应用过程中，不仅仅存在逆转录病毒，同时也存在慢病毒，更是存在一定的腺病毒，病毒基因在实际的插入过程中，存在一定的不可控过程，对于原癌基因的激活有着直接性的影响过程，在各种方法据诶和的过程中，更要避免iPSCS诱导过程中的一种病毒感染，对基因的整合进行有效的避免。其中表达质粒、化学因子、“piggyback”转座子[7]、“自体裂开”多肽[8]相对来说有着一定的成功性。而基于有利基因的载体以及细胞渗透性重组蛋白的相关应用，同样也有着相对成功的效果[9]。

许多诱导因子本具有潜在致癌作用，所以减少诱导因子，优化诱导因子也是研究目标之一。从Nakagawa等和Wernig等的三个诱导因子，到Kim等的两个诱导因子，再到Miura K等[10]只用Oct4一个诱导因子。研究的进步让我们看到进一步优化诱导方法的可能。

4 关于iPSCs用于神经系统细胞治疗的研究进展

iPSCs不仅仅具有无限生长潜能，同时也存在可自体来源的主要特点，在对道德伦理问题避免的过程中，基于一种免疫排斥的过程中，注重神经系统细胞治疗过程中的全面研究和进展。同时细胞治疗的热门靶点也即是一种iPSCs。目前关于iPSCs用于神经系统细胞治疗研究的疾病只有帕金森病和脊髓损伤。

4.1 iPSCs和帕金森病

Tsuji O[10]研究表明，小鼠iPSCs在对多巴胺能神经元分化之后，主要是在体外培养的过程中，将神经前体细胞全面得到，通过在帕金森病大鼠脑部各个部位进行合理的移植，在神经元和受体大鼠不断接触的过程中，结合一种神经元的特点，合理的改善帕金森病的相关症状。Nori S[11]研究表明，而基于一种纤维细胞的研究过程中，结合病因学和毒理学的相关研究，在成体细胞中，对人的iPSCs进行不断的诱导，并逐渐的形成一种多巴胺能神经元，分化效率实际的检测过程中，通过对帕金森病的相关特异性进行全面的检测，并逐步的形成一种多巴胺能神经元的相关细胞。

4.2 iPSCs和脊髓损伤（SCI）

Kobayashi Y[12]等的研究发现鼠iPSCs能分化成神经球，而且其分化结果跟iPSCs的来源有关：鼠胚胎成纤维细胞来源的iPSCs最接近于ESCs分化成神经球的结果。于是翁南川等[13]运用鼠胚胎成纤维细胞来源的iPSCs分化来的神经球治疗鼠脊髓损伤模型，发现iPSCs治疗组的下肢运动功能恢复明显优于对照组，并与ESCs治疗组的疗效等同。他们的研究暗示分化成熟组织来源的iPSCs经过严格的分化评估后可以用于治疗SCI。此后，刘巍等[14]在干细胞治疗终末期缺血性心肌病的进展中通过用人iPSCs分化来的神经球治疗小鼠SCI同样得到积极的结果。在这基础上丁红芳等[15]在绒猴模型上进行了类似的实验研究，结果再次是iPSCs治疗的绒猴下肢运动功能得到显著恢复，并且未出现肿瘤事件。冯涛[16]等在干细胞的临床应用：缺少大动物模型和人体试验的研究中表明，iPSCs在某种程度上和ESCs存在一定的相似度，在多向分化的过程中，其中的潜能，往往将已知的成体干细胞超出。同时郭晓令[17]等在编程诱导多功能干细胞的研究进展中表明，基于人类成纤维细胞样滑模细胞的结构特点，这种源自新生儿的一种纤维细胞，在细胞系诱导过程中，结合iPSCs实际的细胞形态。

5 展望

iPSCs作为一种细胞移植模型，有着理想性的特点，在体外高度增值的过程中，存在相对未成熟表型的一种可塑性，在实际的增值分化过程中，有着可控性的特点。同时iPSCs在某种程度上和ESCs存在一定的相似度，在多向分化的过程中，其中的潜能，往往将已知的成体干细胞超出，并基于一种伦理学的角度，对于患者疾病相关特异性的iPSCs，将免疫排斥问题有效避免。iPSCs在实际的取材过程中，不仅仅有着简单性的特点，同时也存在无创的特点，在某种程度上很容易被患者接受。在再生医学领域的发展过程中，iPSCs存在一定的竞争力，从根本上为再生医学难题的解决带来了一定的前景和希望。

但是，目前iPSCs治疗脑卒中的研究还存在以下几个问题：①iPSCs尚未解决的关于脑卒中细胞治疗研究方法的问题：包括脑卒中模型的选定和制作；使用确切的预后评定标准；治疗窗的选定；治疗剂量、注射方式的选定等等。②iPSCs研究的不成熟：如病人特异性iPSCs诱导生成的低效率；iPSCs形成肿瘤的危险性等等。这些问题很有可能在不远的将来被严密有效的分化和筛选技术所解决。③iPSCs实际来源过程中，主要是结合神经元对脑卒中进行治疗的一种机制，iPSCs的科学研究正在飞速发展，相信人类的智慧将克服一个个难题，而iPSCs必定为脑卒中的细胞治疗开辟一片新的天地。

[参考文献]

[1] 熊杰，宁丽娜，王再领，等. 干细胞治疗神经退行性疾病的前景与问题 [J]. 中国组织工程研究，2013，19（30）：3573-3580.

[2] 刘文骏，张辉，尹宗生. 诱导多功能干细胞治疗脊髓损伤的现状及思考 [J]. 中国组织工程研究，2013，27（5）：5094-5100.

[3] 邓君，陈晓，晏颖，等. 诱导多功能干细胞在视网膜疾病中的应用 [J]. 中国组织工程研究，2013，36（1）：6533-6540.

[4] 秦洁. 诱导多能干细胞来源的神经干细胞移植治疗脑出血的实验研究 [D].郑州：郑州大学，2014.

[5] 郭子宽. 间充质干细胞及其临床应用中的几个问题 [J]. 中国组织工程研究，2012，1（4）：1-10.

[6] 方敏，陈治军，武栋成. 干细胞移植治疗缺血性脑卒中的研究进展 [J]. 卒中与神经疾病，2012，2（8）：123-127.

[7] 王格，陈哲，武栋成. 诱导多功能干细胞的研究进展 [J]. 中国组织工程研究与临床康复，2011，23（10）：4344-4350.

[8] 彭锐. 神奇的干细胞[J].大自然，2014，2（6）：56-57.

[9] Miura K， Okada Y， Aoi T， et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines[J]. Nat Biotechnol 2009（27）：743-745.

[10] Tsuji O， Miura K， Okada Y， et al. Therapeutic potential of appropriately evaluated safe-induced pluripotent stem cells for spinal cord injury[J]. Proc Natl Acad Sci 2010（107）：12704-12709.

[11] Nori S， Okada Y， Yasuda A， et al. Grafted human-induced pluripotent stem-cell–derived neurospheres promote motor functional recovery after spinal cord injury in mice[J]. Proc Natl Acad Sci2011（108）：16825-16830.

[12] Kobayashi Y， Okada Y， Itakura G， et al. Pre-evaluated safe human iPSC-derived neural stem cells promote functional recovery after spinal cord injury in common marmoset without tumorigenicity[J]. PLoS One. 2012，7（12）：e52787

[13] 翁南川， 张骏， 詹仁雅，等. 诱导多功能干细胞——帕金森病治疗的未来[J]. 中华神经外科学杂志， 2010， 12（26）： 1114-1117.

[14] 刘巍，王悦涵，周玉杰. 干细胞治疗终末期缺血性心肌病的进展[J]. 心肺血管病杂志，2015，2（12）：141-143.

[15] 丁红芳. 胎盘间充质干细胞输注在缺氧缺血脑损伤模型中的研究 [D].济南：山东大学，2014.

[16] 冯涛，考晓明，嵇武. 干细胞的临床应用：缺少大动物模型和人体试验[J]. 中国组织工程研究，2014，14（2）：2269-2274.

[17] 郭晓令，刘庆，王婵，等. 重编程诱导多功能干细胞的研究进展[J]. 中国病理生理杂志，2014，7（3）：1218-1222，1227.

（收稿日期：2015-03-05）