高效液相色谱法测定奥硝唑分散片含量

天津医科大学代谢病医院（300070）周瑾

天津医科大学（300070）刘照胜

奥硝唑分散片用于治疗由厌氧菌（脆弱拟杆菌、狄氏拟杆菌、卵园拟杆菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、梭状芽胞杆菌、真杆菌、消化球菌和消化链球菌、幽门螺杆菌、黑色素拟杆菌、梭杆菌、CO2噬织维菌、牙龈类杆菌等）感染引起的多种疾病；男女泌尿生殖道毛滴虫、贾第氏鞭毛虫感染引起的疾病（如阴道滴虫病等）；肠、肝阿米巴虫病（包括阿米巴痢疾、阿米巴肝脓肿），肠、肝变形虫感染引起的疾病；用于预防和治疗各科手术后厌氧菌感染。本文以替硝唑为内标，采用反相HPLC法测定奥硝唑的含量，用于奥硝唑分散片的质量控制。结果表明，本法简便准确，适用于奥硝唑制剂的常规质量控制。

1 仪器与试药

岛津LC一10AT 型HPLC 仪，包括SPD一10A 型紫外检测器、LC—R6A 型数据处理机和7725型定量进样器。奥硝唑对照品(自制，含量99.4%)、甲硝唑对照品(中国药品生物制品检定所，含量99.8%，批号07254)；乙腈（色谱纯）；KH2PO4（分析纯，批号070221，天津化学试剂二厂）；盐酸（分析纯，批号071003，天津化学试剂二厂），实验用水为双蒸馏水；奥硝唑分散片（0.2 5 g/片，国药准字H20040375，批号：20130518，20130608，20130825，河南天方药业有限公司）。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱为Shimpack CLC—ODS柱(4.6 mm×150 mm,5u)；流动相乙腈-KH2PO4(0.01 mol·L-1)(22∶78，v/v)，使用前超声脱气20min，0.45μm微孔滤膜抽滤；流速1.0ml／min；检测波长310nm；进样量10μl；柱温为室温。在上述色谱条件下，模拟处方中，奥硝唑的出峰时间为5.8min，替硝唑出峰时间为2.7min；按奥硝唑峰计算理论板数不低于1000，奥硝唑与甲硝唑的色谱峰分离度大于1.5。色谱图见附图1。

2.2 溶液制备

附图1 模拟处方中奥硝唑与甲硝唑色谱图

附图2 模拟空白处方

附表1 回收率测定结果（n＝9）

附表2 精密度试验结果（n＝9）

附表3 三批奥硝唑分散片的含量测定结果

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取经五氧化二磷减压干燥至恒重的奥硝唑对照品与甲硝唑对照品各约25mg，精密称定，分别置50ml量瓶中，加流动相适量，超声10min使溶解，放冷，加流动相至刻度，摇匀，分别得到奥硝唑对照储备液及甲硝唑（内标）液。精密量取1.0 ml奥硝唑对照储备液，置25ml量瓶中，再精密加入内标液1.0ml，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到对照品溶液 (奥硝唑浓度为20μg/ml，内标物浓度为20μg/ml)。

2.2.2 供试液的配制 取供试品10片，精密称定，求出平均装量。将胶囊的内容物混合均匀，研细，精密称取适量，（约相当于奥硝唑25mg），置于50ml量瓶中，加流动相适量，超声处理5min，使奥硝唑溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，置另25ml量瓶中，精密加入内标液1.0 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液（约相当于奥硝唑20μg/ml）。

2.3 结果

2.3.1 空白对照 按处方工艺制备不含奥硝唑的模拟制剂，按供试液配制方法，制备不含内标物的空白对照，10μl进样，得到附图2，说明处方中敷料不影响奥硝唑的测定。

2.3.2 线性范围 精密量取不同体积奥硝唑对照液储备液，分别置25ml量瓶中，精密加入1.0ml内标液，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别配成浓度为4、8、16、24、32及40μg/ml的对照液，分别进样10μl，记录不同浓度的色谱峰面积，以浓度C对奥硝唑对替硝唑的峰面积比（A1/A2）做最小二乘法线性回归分析，得到回归曲线为A1/A2＝4.220C+0.054（r＝0.9998，n＝5）。结果显示，峰面积比与奥硝唑浓度之间的线性关系良好。

2.3.3 准确度实验

2.3.3.1 校正因子f的测定 精密量取不同体积的对照液储备液，分别置25ml量瓶中，分别精密加入1.0ml内标液，以流动相稀释至刻度，得到浓度分别为16μg/ml、20μg/ml及24μg/ml的三种溶液。每个浓度分别进样3次，每次10μl，按公式f＝（A内标/C内标）/（A对照/C对照）计算f值，f的平均值为0.931。

2.3.3.2 回收率的测定

取三份模拟的空白处方，分别置50ml量瓶，分别精密加入不同量的苯酰甲硝唑对照品，加流动相适量，超声处理5min，用流动相稀释至刻度，摇匀。滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1.0ml，置另一25ml量瓶中，精密加入一定量的内标液，用流动相稀释至刻度，摇匀。10μl进样，每个浓度重复测定3次，测得奥硝唑与内标物的峰面积，计算奥硝唑回收率，结果见附表1。

2.3.4 精密度试验

2.3.4.1 重复性试验 在同一时间内，由一名实验人员分别配制不同含量的苯酰甲硝唑的模拟处方，按“2.2.2供试液配制”规定方法配制待测样品，使奥硝唑的浓度分别为16、20、24μg/ml，进样10μl，每个浓度重复3次，测定奥硝唑及内标物的峰面积，计算9次测定的f值的RSD，结果见附表2。结果表明，本方法重复性良好。

2.3.4.2 中间精密度试验 在不同日期内，由不同分析人员分别配制不同含量的奥硝唑的模拟处方，按“2.3供试液配制”规定方法配制待测样品，使奥硝唑的浓度分别为16、20、24μg/ml，进样10μl，每个浓度重复3次，测定奥硝唑及内标物的峰面积，计算9次测定的f值的RSD，结果见附表2。结果表明，本方法中间精密度较好。

2.3.4.3 供试液稳定性试验 取2.2.2项下的供试品溶液，自然放置，分别于0、2、6、12小时进样10ul，测定奥硝唑与甲硝唑的面积比（A1/A2）， 考察供试液的稳定性，结果表明，12小时内的A1/A2RSD为1.07%，供试液在12小时内稳定。

2.3.5 样品测定 取不同批号的奥硝唑分散片，分别按“2.2.2项下”规定处理，测定每批奥硝唑相对标示量的百分含量，结果见附表3。

3 讨论

根据文献报道[1][2][3][4]，奥硝唑的测定一般采用甲醇一水或甲醇一磷酸缓冲盐作流动相，以甲硝唑为内标测定奥硝唑的含量。通过试验比较，我们发现甲醇一水或甲醇一磷酸缓冲盐体系效果均不理想，供试液不稳定。改用乙腈-KH2PO4(0.01 mol·L-1)(22∶78，v/v)后，色谱峰分离理想，色谱系统适用性指标均令人满意。

反相高效液相色谱技术具有灵敏、简便、分离效能高等优点，目前已经广泛应用。应用此技术对分析奥硝唑分散片的含量有很大意义，本文方法准确度高，精密度及样品稳定性均较好，可作为实践中常规应用的一种简便、可靠、快速的分析方法。