斑马鱼socs2的TALEN敲除及其敲除胚胎的生长研究

王华林 朱作言 孙永华

(1. 中国科学院水生生物研究所, 淡水生态与生物技术国家重点实验室, 武汉 430072; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

生长激素(Growth hormone, GH)是一种由191个氨基酸组成的肽类激素, 它由垂体前页分泌, 是调节机体生长发育的重要因子。朱作言等[1]将含有人生长激素基因的重组质粒pMhGH注射到泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)的受精卵内, 由此发育的转基因泥鳅显示出快速生长效应。外源生长激素基因在鱼类中的这种促生长效应在鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus)中也得到了验证[2]。生长激素的这一效应由细胞膜上的生长激素受体(Growth hormone receptor, GHR)介导, GH在与GHR结合后导致该受体二聚化, 活化后的GHR会激活詹纳斯激酶 2 (Janus kinase 2, JAK2), 使GHR上的酪氨酸(Tyr)位点被磷酸化,该磷酸化位点与被GHR募集的信号转导及转录激活蛋白(Signal transducer andactivators of transcription, STAT)结合, STAT分子继而被JAK2磷酸化并形成二聚体, 活化后的STAT进入到细胞核并激活其下游的c-fos和igf1等靶基因的表达[3,4]。

细胞因子信号转导阻抑物(Suppressors of cytokine signaling, SOCS), 特别是SOCS2在生长激素信号通路的调控中具有重要作用。socs2敲除的小鼠比野生型个体长得更快, 其体重增大, 体长增加至野生型的 1.5倍[5,6],呈现出与转生长激素基因小鼠[7]类似的快速生长效应。目前, 国内外的研究主要探讨了socs2与GH信号通路的相互作用和其对小鼠生长的调控作用, 而它对鱼类生长发育的调控及其生化机理尚不清楚。本研究以斑马鱼为模型, 利用类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)敲除了socs2基因, 以探索socs2对鱼类GH信号通路的调控作用。

TALEN技术是近年发展起来的一类新型的人工核酸内切酶, 它由TALE (Transcription activator-like effector)靶点识别序列和FokⅠ核酸内切酶两个结构域组成, 前者能识别并结合靶点 DNA序列, 然后由后者将靶点 DNA序列切开, 实现对基因组序列的定点突变。该技术对基因组 DNA的编辑效率高, 脱靶率较低, 目前已广泛应用于遗传学、分子生物学等领域的研究[8]。由于FokⅠ核酸内切酶结构域通常以二聚体的形式起作用, 所以TALEN靶点也需要成对选择。本研究利用TALEN技术研制了socs2缺陷型斑马鱼突变体, 发现其胚胎早期的生长速率显著快于对照组野生型斑马鱼, 研究结果将为鱼类分子设计育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用AB品系斑马鱼由国家斑马鱼资源中心提供。TALE单体质粒系列, pCS2-PEAS和pCS2-PERR载体由北京大学生命科学学院张博教授提供。

1.2 TALEN靶点设计及表达载体构建

TALEN靶点的选择与确认 为尽可能完全地破坏socs2的结构与功能, 靶点选择在socs2 CDS的5¢端, 靶点选择遵循的原则参见沈延等[9]提供的方法。为方便后续筛选过程中用酶切的方法来检测突变体, 选择了左右识别位点中间含有单一的 TaqⅠ酶切位点的的靶点, 靶点位置及序列见图 1。在 Ensembl网站上分别用单侧靶点序列进行BLAST比对[10], 确认该序列在斑马鱼基因组中是单一位点。

图1 斑马鱼socs2的TALEN靶点示意图Fig. 1 Structure and sequence of socs2 and the TALEN target site

靶点序列及酶切效率确认 取实验用 AB品系斑马鱼20枚, 用Genomic DNA Kit(TIANGEN) 提取基因组DNA, PCR扩增靶点及附近序列。PCR反应条件: 95℃预变性3min; 95℃变性30s, 51.5℃退火30s, 72℃延伸45s,扩增 35个循环。PCR反应体系: 10ÍTaq Buffer 5 μL,MgCl22.5 mmol/L, dNTP Mix0.8 mmol/L, 引物TALEN2-F和 TALEN2-R 各 0.4 μmol/L, 基因组 DNA 0.15 μg, Taq DNA聚合酶(Fermentas)1 U, 加ddH2O至50 μL。用PCR Cleanup试剂盒(AXYGEN)回收扩增产物, 取一部分产物用TaqⅠ酶切。另取一部分回收的扩增产物测序确认靶点序列及其中间的的TaqⅠ识别序列中无SNP及其他变异。

构建 TALEN表达载体 根据选择的靶点序列,首先以TALE单体质粒系列为基础, 采用“单元组装法”通过酶切连接把单体质粒串联起来, 分别构建成识别左右靶点的TALE重复序列并测序鉴定。将组装好的TALE重复序列酶切后连接到含有 FokⅠ编码序列的载体pCS2-PEAS和pCS2-PERR上, 用引物GFor与+63dnPCR鉴定TALE片段(左)连入方向, 用引物CFor与+63dnPCR鉴定TALE片段(右)连入方向, 挑选连入方向正确的单克隆测序鉴定, 构建成TALEN终载体pCS2-TALEN。具体构建步骤与方法参见沈延等[9]提供的方法。

1.3 TALEN活性检测与斑马鱼突变体筛选

TALEN mRNA体外转录及其显微注射 通过NotⅠ酶切线性化 pCS2-TALEN载体对, 线性化完全后用mMessagemMachine®SP6试剂盒(Ambion)体外转录得到左、右两侧半位点的一对TALEN mRNA。转录产物用PCR Cleanup试剂盒(AXYGEN)回收, 溶于DEPC H2O中。用分光光度计测定 mRNA浓度, 将左、右两侧半位点的一对TALEN mRNA混和, 加入DEPC H2O和1/10体积的酚红, 配制成 200 ng/μL 的 TALEN mRNA。将配制好的TALEN mRNA显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中(注射量: 50—150 pg/半位点), 得到 F0胚胎。同时留一些未注射的同批胚胎作为对照。

TALEN体内活性检测 受精后 2天(2 dpf, day post-fertilization), 取注射的胚胎 20个, 同批的对照组也取20个胚胎, 分别提取基因组DNA, PCR扩增靶点周围的序列(用“1.2”中鉴定过的引物)。扩增产物用 PCR Cleanup试剂盒(AXYGEN)回收后用 TaqⅠ酶切, 酶切完全后用琼脂糖凝胶电泳检测。如果有未切开的PCR条带且对照组胚胎的 PCR 产物能够全部被切开, 说明靶点DNA序列可能发生突变; 将未切开的条带用Gel Extraction Kit (Fermentas)切胶回收, 连入 T载体 pMD18-T(TAKARA), 测序鉴定靶点的突变情况。

表1 实验所用引物Tab.1 Primers used for all the experiments

斑马鱼 TALEN突变体筛选 将检测到突变的 F0胚胎饲养至性成熟, 与野生型(WT)成鱼测交, 取所产 F1胚胎20个提取基因组DNA, PCR扩增靶点周围的序列并用TaqⅠ酶切鉴定。选取 F1胚胎发生突变的F0鱼测交, 大量饲养F1至性成熟。取F1成鱼剪尾鳍提取基因组 DNA,逐条进行基因型分析(依次通过PCR、酶切、测序检测靶位点序列)。筛选到基因型完全一致的雌雄成对的F1杂合子突变体, 通过自交获得含有1/4纯合子突变体的F2胚胎,饲养至性成熟并进行基因型分析(图2)。

1.4 斑马鱼胚胎生长速率测定与统计分析

将筛选得到的socs2缺失的斑马鱼纯合子分别与同批的纯合子和野生型杂交, 得到socs2缺失的纯合子胚胎和杂合子胚胎。再将同批的野生型成鱼自交, 得到野生型胚胎。这3组胚胎分别用胰蛋白酶脱膜, 各取31枚胚胎饲养至同样大小的培养皿中, 置于28℃恒温培养箱中培养。分别取24、48、72和96hpf的胚胎用Tricaine麻醉, 然后拍照并用 SPOT5.0软件测量体长, 记录体长数据并分析三组数据间的统计学差异。

1.5 GH信号通路活性分析

取 2dpf的socs2敲除的纯合子、杂合子和野生型胚胎各50枚, 用Trizol (Invitrogen)提取总RNA, 用分光光度计测定浓度并电泳检测RNA质量。用DNaseⅠ(Promega)处理以去除其中可能含有的 DNA, 用 RevertAidTMcDNA synthesis Kit (Fermentas)反转录制备cDNA[11]。所得cDNA用ddH2O稀释5倍后作为模板, real-time PCR分析GH信号通路下游靶基因c-fos(基因ID: 190339985)和igf1(基因ID: 90017461)的表达变化[12]。Real-time PCR体系:2×SYBR Green supermix(BioRad) 10 μL, 上下游引物各0.2 μmo/L, cDNA 模板 150 ng, 加 ddH2O 补至 20 μL。每一个样品平行做 3个重复, 每个基因的表达量以 β-actin为参照用 2–∆∆Ct法[13]分析和处理实验数据。

图2 socs2缺失的斑马鱼纯合子突变体筛选流程Fig. 2 Crossing schemes to breed socs2–/– homozygous mutant zebrafish

2 结果

2.1 斑马鱼socs2缺陷型突变体的获得

注射了socs2 TALEN mRNA的胚胎, 其socs2基因经测序鉴定检测到了1—11个碱基不等的缺失突变, 也有碱基缺失后插入了1—8个碱基不等的插入突变(图3)。除去3碱基缺失、6碱基缺失和9碱基缺失外, 其余均为有效突变。F1代成鱼中筛到了13个碱基(CACGGAAAGCATC)缺失的杂合子突变体雄鱼和雌鱼, 自交后得到 F2代, F2代成鱼逐尾进行基因型分析得到了13个碱基(CACGGAA AGCATC)缺失的纯合子突变体, 自交得到 F3代胚胎, 基因型鉴定证明其全部为socs2(-13)纯合子突变体(图4A)。在该突变体中碱基缺失造成移码突变, 导致翻译提前终止。突变的SOCS2蛋白只保留了野生型SOCS2氮末端的8个氨基酸, 又因移码产生了23个新的氨基酸(RMKGDR NPKPKSPTPSRVALPLP), 缺乏 SOCS2行使其生物学功能所需的Src同源结构域(Src-homology 2, SH2)和SOCS盒(SOCS box)结构域(图 4B)。

2.2 socs2敲除对斑马鱼胚胎生长速率的影响

斑马鱼 socs2(-13)突变体胚胎在 1dpf和 2dpf的体长均大于同批的野生型。1dpf的体长: 杂合子突变体>纯合子突变体>野生型, 杂合子突变体体长比野生型增加了3.5%, 在统计学上存在极显著的差异(P<0.005)。2dpf的体长: 杂合子突变体>纯合子突变体>野生型, 杂合子突变体体长比野生型增加了 3.1%, 纯合子突变体体长比野生型增加了 2.2%, 两组数据与野生型对比都有显著的统计学差异(P<0.05)。当胚胎发育至3dpf和4dpf, 杂合子突变体的这一生长优势逐渐减弱, 3种基因型胚胎的体长数据无显著性差异(图5)。

2.3 socs2敲除对GH信号通路活性的影响

由于2dpf的socs2(-13)突变体胚胎的体长显著大于同时期的野生型胚胎, 我们采用实时荧光定量 PCR分析了这一时期的突变体和野生型中 GH信号通路下游靶基因c-fos和igf1的表达量(图 6)。结果显示c-fos的表达量在socs2(-13)杂合子胚胎中上调了 1.4倍, 在 socs2(-13)纯合子胚胎中上调了 2.6倍。igf1的表达量在 socs2(-13)纯合子胚胎中上调了3.9倍。

3 讨论

图3 F0代斑马鱼胚胎中socs2 TALEN位点突变检测结果Fig. 3 Sequences of socs2 mutations induced by TALEN in founder zebrafish embryos

图4 F3代纯合子胚胎中socs2突变检测结果Fig. 4 Sequences of socs2 mutations in homozygous embryos

图5 野生型、socs2 (-13)杂合子和socs2(-13)纯合子的体长Fig. 5 Body length in the wildtype (WT), socs2+/–, socs2–/–groups

本研究表明 socs2的缺失可轻微地促进斑马鱼胚胎的生长, 而这种促生长效应并不是在胚胎发育过程中一直持续下去, 其在1dpf和2dpf有显著的促生长效应, 但是对3dpf和4dpf的胚胎并没有显著的促生长效应。这可能是因为机体对socs2的缺失造成的影响做出应答后迅速上调了其他GH信号通路抑制因子的表达, 使得机体生长速度趋于正常生理水平。蛋白酪氨酸磷酸酶(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase,SHP)可能是这一过程中被上调的重要因子, 其被证明能抑制生长激素所介导的JAK2/STAT信号传导途径[14]。SHP能与 GHR的 Tyr595结合, 这一相互作用被证明与GH信号通路的下调有关, 把这一位点的 Tyr突变为Phe后, GH信号通路活性被上调[15]。后来的研究发现SOCS2也能与GHR的Tyr595结合[16], 这说明该位点同时也是SOCS2在GH信号通路中行使其负反馈抑制功能的作用位点, SHP可能会竞争性抑制SOCS2与Tyr595的结合。在本研究中3dpf和4dpf时突变体胚胎的体长与野生型逐渐趋于同一水平, 可能就是因为 SOCS2与GHR上磷酸化位点的亲和力降低间接诱导和增强了SHP与GHR上Tyr595位点的结合。

本研究还发现在 1dpf和 2dpf时, 生长最快的不是socs2(-13)的纯合子胚胎, 反而是杂合子突变体的体长与野生型胚胎的差异更为显著。这说明并不是 socs2的表达水平越低, 斑马鱼的生长就越快, socs2对GH信号通路的调控可能是一个双向作用的过程。Adams等就发现在CHO细胞系中高表达socs2反而会增强GH信号通路的活性[17]。进一步的研究也证实了socs2对GH信号通路的调控是双向的, 当逐渐增加 socs2的表达量时,其对293T细胞中GH信号通路的抑制效应逐渐减弱, 反而逐渐增强信号通路下游与STAT5结合的启动子活性[18]。转入外源socs2的转基因小鼠其生长速率也并没有降低,反而从3周开始显著大于同龄的野生型小鼠[16]。这些报道与我们的结果是一致的, 进一步说明 socs2在体内的抑制生长或是促生长效应可能是双向的, 而这种双向作用可能与SHP等其他GH信号通路抑制因子的竞争性作用是相关的。

本研究证明 socs2(-13)的杂合子和纯合子突变体中GH信号通路下游的靶基因 c-fos的表达量显著高于野生型, 另一个靶基因igf1在纯合子突变体中也显著增加。这说明socs2的缺失减弱了其对GH信号通路的抑制, 导致GH信号通路活性的上调。但是c-fos和igf1的表达量不是在体长最长的杂合子突变体中最高, 而是在体长介于中间的纯合子突变体中最高。我们推测这可能是杂合子突变体中表达的部分SOCS2对STAT5的磷酸化起到了一定的抑制作用, SOCS2的这种抑制作用在体外实验中有过详细的验证[19]。纯合子突变体中STAT5的磷酸化则不会受到 SOCS2的抑制, 同时整个 GH信号通路也不被SOCS2抑制, 所以下游靶基因在纯合子突变体中的表达量上调得更为显著。

图6 socs2突变体胚胎中c-fos和igf1 mRNA的表达Fig. 6 Expression levels of the c-fos and igf1 genes in zebrafish embryos

总之, 本研究证明socs2的缺失会对斑马鱼胚胎发育早期的生长速率产生影响, 这种效应与缺失突变体中GH信号通路活性的上调有关。针对突变体中 STAT5磷酸化水平和GH表达量的进一步研究将有助于深入理解socs2在斑马鱼体内调控GH信号通路的机理。