丹参对单侧输尿管结扎模型大鼠肾脏TGF-β1及MCP－1表达的影响*

钟　丹　邹亦平　延卫东　黄宇清　陈小丽　王　娟

（1.井冈山大学临床医学院，江西吉安343009；2.井冈山大学附属医院，江西吉安343009）

·研究报告·

丹参对单侧输尿管结扎模型大鼠肾脏TGF-β1及MCP－1表达的影响*

钟丹1邹亦平2延卫东1黄宇清1陈小丽2王娟1

（1.井冈山大学临床医学院，江西吉安343009；2.井冈山大学附属医院，江西吉安343009）

目的观察丹参对单侧输尿管结扎（UUO）模型大鼠肾脏TGF-β1及MCP-1表达的影响，初步探讨其抗肾间质纤维的机理。方法应用单侧输尿管结扎致肾间质纤维化大鼠模型，SD雄性大鼠120只随机分为空白组，模型组，丹参高、中、低剂量组，吡格列酮组，每组20只，从模型建立前48 h开始灌胃，于造模后第7天，留取梗阻侧肾脏，采用免疫组化方法检测肾组织TGF-β1及MCP-1的表达，RT-PCR方法检测TGF-β1及MCP-1 mRNA的表达。结果与空白组相比较，UUO模型组中TGF-β1、MCP-1表达明显增高，丹参高、中剂量组TGF-β1、MCP-1表达水平明显低于UUO模型组（P＜0.05或P＜0.01）。结论丹参可通过抑制UUO模型大鼠肾组织TGF-β1、MCP-1蛋白及其mRNA的表达，从而起到肾脏保护和抗肾间质纤维化的作用。

丹参肾间质纤维化TGF-β1MCP-1

肾间质纤维化是多种肾脏疾病的最后阶段，是肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同通路，采用各种措施来阻止肾纤维化的发生发展是临床防治肾小管间质病变，延缓肾功能衰竭的重要手段。中医学认为“血瘀证”贯穿于肾纤维化的所有阶段，在慢性肾病的防治中活血化瘀类中药占有重要地位。有鉴于此，本研究拟观察活血类中药丹参对单侧输尿管结扎大鼠模型肾组织病变的影响，探讨其抗肾间质纤维化的机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物健康SD雄性大鼠，体质量（200±10）g，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0003467。适应性喂养1周后，进行实验。

1.2试剂与仪器1）实验药物。丹参水煎液：采用江西本地产丹参，自行制备成水煎液。吡格列酮购自杭州中美华东制药有限公司，国药准字H20050500。2）试剂。TRIzol RNA提取试剂盒（Invitrogen公司）；Platinum Taq DNA Polymerase（Invitrogen公司）；ThermoScript RT-PCR System试剂盒（Invitrogen公司）；兔抗鼠TGF-β1、MCP-1（武汉博士德生物工程有限公司）；两步法免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3分组与造模将实验动物随机分为：空白组、模型组、吡格列酮组、丹参低剂量组、丹参中剂量组、丹参高剂量组，每组20只，自由饮水、进食。造模及给药方法：采用UUO造模方法，戊巴比妥钠皮下注射麻醉（5 mg/kg）大鼠，打开腹腔后结扎左侧输尿管，缝合腹腔。各组均于模型建立前48 h灌胃，丹参灌胃量分别按3、2、1 g/（kg·d）灌胃给药，每日给药1次。模型组以等量0.9%氯化钠注射液灌胃。吡格列酮组灌胃量为30 mg/（kg·d）。

1.4观察指标免疫组化检测，以造模后第7天为观察时点，游离梗阻侧肾，扇形切取部分肾脏织，免疫组化染色采用SP法步骤：3 μm石蜡切片脱蜡，水化后以3%H2O2去离子水孵育，以阻断内源性过氧化物酶，抗原热修复，正常山羊血清封闭后，分别滴加一抗TGF-β、MCP-1孵育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液孵育。应用DAB溶液显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。每次染色均以PBS代替一抗做阴性对照。在每张切片不包含肾小球和血管的间质区域随机选取10个高倍镜视野（×200），用彩色病理图文报告分析系统对所选取视野中免疫组化阳性信号进行图像分析，计算每个视野中TGF-β1、MCP-1各自阳性染色面积占总视野面积的百分比，并计算其均值。采用RT-PCR技术检测TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA的表达，应用Trizol试剂盒提取肾组织总RNA，运用逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA，以β-actin为内对照，进行半定量逆转录聚合酶链反应。引物设计如下，TGF-β1：上游5'-AGCCTGCTTCTTGAGTC-3'下游引物下游5'-AGGAAAGGTAGGTGATA-3'，基因扩增片断长度为241 bp。MCP-1：上游5'-CATCCACTCTCTT TCCACAAC-3'，下游5'-ACATTGAAAGTGTTGAAC CAGG-3'，基因扩增片断长度为222bp。β-actin：上游引物5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC-3'，下游引物：5'-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG-3'，基因扩增片断长度为216 bp。均经测序鉴定证实。聚合酶链反应条件根据RT-PCR试剂盒推荐条件优化，每次PCR反应至少重复3次。聚合酶链反应产物用含0.5 m/L溴化乙啶的1.5%琼脂凝胶电泳分析。根据双标准曲线法，以目的基因与β-actin基因mRNA水平比值作为目的基因mRNA的相对表达量，即目的基因Ct值与β-actin基因Ct值的比值，比值越大，说明目的基因的表达越少。

1.5统计学处理采用SPSS13.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差不齐者改用秩和检验的Kruskal-Wallish方法进行多个样本比较及两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠肾组织TGF-β1及MCP-1表达的比较见表1。与空白组比较，模型组肾小管上皮细胞、肾间质细胞胞核TGF-β1强阳性表达，吡格列酮组及丹参各剂量组TGF-β1表达水平低于UUO模型组（P＜0.05）；与空白组比较，模型组及各治疗组MCP-1表达明显较低（P＜0.05），与模型组比较，丹参高、中剂量组MCP-1表达增高，其中丹参高剂量组表达增高有统计学（P＜0.05）。

表1　各组大鼠肾组织TGF-β1及MCP-1表达的比较（）

表1　各组大鼠肾组织TGF-β1及MCP-1表达的比较（）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别nTGF-β1MCP-1空白组60.48±0.230.32±0.10模型组62.68±0.23△△0.27±0.18△吡格列酮组60.97±0.21*0.28±0.11△丹参高剂量组60.68±0.26*0.30±0.01*丹参中剂量组60.81±0.56*0.28±0.01△丹参低剂量组60.89±0.33*0.27±0.01△

2.2各组大鼠肾组织TGF-β1mRNA及MCP-1 mRNA表达的比较见表2。与空白组比较，模型组TGF-β1mRNA表达明显较强（P＜0.01）；各药物治疗组TGF-β1mRNA的表达均较模型组降低，其中丹参高剂量组降低尤为明显。与空白组比较，模型组MCP-1 mRNA明显较低（P＜0.05），各药物治疗组MCP-1 mRNA的表达均较模型组低（P＜0.05），与吡格列酮组比较，丹参高剂量组MCP-1 mRNA的降低明显（P＜0.05）。

表2　各组大鼠TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA Ct值比较（）

表2　各组大鼠TGF-β1mRNA、MCP-1 mRNA Ct值比较（）

与吡格列酮组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别nTGF-β1MCP-1空白组60.31±0.100.29±0.12模型组61.13±0.08△△1.87±0.13△△吡格列酮组60.99±0.21*1.73±0.16*丹参高剂量组60.61±0.06**▲0.98±0.11*▲丹参中剂量组60.69±0.09*▲1.25±0.15*▲丹参低剂量组60.93±0.03*1.76±0.16*

3　讨论

肾间质纤维化是各种形式肾脏病发展的最终共同途径，纤维化程度预示着肾功能受损的程度，决定着慢性肾脏病患者的预后。但其发病机制非常复杂，目前尚未完全阐明。研究揭示［1］，炎症细胞浸润，肾小管、肾间质细胞在致纤维化性生长因子、各种细胞因子等作用下损伤和活化、细胞外基质（ECM）的过度积聚等原因是肾间质纤维化形成的重要机制。

本实验采用UUO模型，UUO是较为公认的导致肾间质纤维化病理学改变的模型，在输尿管梗阻后会先后出现肾间质炎性和纤维化等多样性病理学改变，最终导致肾功能衰竭。

巨噬细胞的侵润作用在促进肾间质纤维化中起着至关重要的作用。研究表明［2］，MCP-1在多种肾脏疾病中参与了小球和间质的巨噬细胞积聚，而阻断MCP-1可以减少巨噬细胞积聚并伴肾脏损伤的减轻。肾脏各种细胞在多种刺激下都可释放MCP-1，促使肾组织单核巨噬细胞浸润，从而分泌大量的细胞因子，如TGF-β1等，启动或扩大炎症反应，导致ECM的积聚、肾脏纤维化的发生。TGF-β1是目前公认的重要的致纤维化生长因子［3］，它通过多个环节导致ECM过度积聚，其中TGF-β1是一种目前研究最多且公认的强致纤维化因子，受多种因子的调节，有研究［4-6］表明MCP-1能上调TGF-β1的表达。因此，抑制MCP-1从而减少TGF-β1的表达可能是治疗肾间质纤维化的有效途径之一。

在肾纤维化过程中，由于血流动力学指标的改变，凝血机制被激活，促成纤维素于肾组织中沉积，并刺激血小板凝集，形成血栓以及肾脏病理学的改变（如细胞外基质的积聚、血管襻、细胞的增殖，纤维蛋白样物的沉积、血栓形成、血管闭塞、局灶或节段性肾小球硬化与间质纤维化等），与中医学“血瘀”理论相符［7-8］。丹参是活血化瘀的代表药物之一，对心脑血管系统、泌尿系统、免疫系统及呼吸系统等疾病均有显著作用［9-10］。对中药抗肾纤维化用药规律探析结果表明丹参在24味常用的活血化瘀药物中使用频次高居第一位［11］，进一步说明丹参在抗纤维化方面疗效肯定。

本研究结果表明，丹参在肾间质纤维化早期可以通过抑制TGF-β1、MCP-1的表达，从而减轻肾小管间质的微观病理损害，起到抗肾小管—间质纤维化的作用，而且这种作用具有剂量的依赖性，以丹参大剂量效果最为明显。

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Effect of Salvia Miltiorrhiza on Renal Expression of TGF-β1 and MCP-1 in Rats with Unilateral Ureter-al Obstruction

ZHONG Dan，ZOU Yiping，YAN Weidong，et al.
Clinical Medical School of Jinggangshan University，Jiangxi，Ji′an 343000，China

【Abstracrt】Objective：To investigate the effect of Salvia miltiorrhiza on the expression of monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1）and transforming growth factor-β1（TGF-β1）in the rats with unilateral ureterai obstruction（UUO）and evaluate the protective effect of Salvia miltiorrhiza against renal interstitial fibrosis.Methods：120 male Sprague-Dawley rats were divided into 6 groups：the normal control group，the model group，the Salvia miltiorrhiza group（low dose，middle dose，high dose）and Piloglitazone group，20 rats in each group.48 hours before the modeling，the rats received intragastric administration.On 7th day after modeling，side kidney was taken，and TGF-β1 and MCP-1 were detected with Immunohistochemical method and their mRNA expressions were detected with the method of RT-PCR.Results：The levels of TGF-β1and MCP-1 expression were obviously higher than those in the normal control group，and compared with the model group，it obviously reversed these changes in middle dose and high dose of Salvia miltiorrhiza.Conclusions：Salvia miltiorrhiza can decrease the expression of TGF-β1and MCP-1 in the UU0 rats，and reduce the extent of renal fibrosis.

Salvia miltiorrhiza；Renal fibrosis；Transforming growth factor-β1；Monocyte chemoattractant protein-1

R285.5

A

1004-745X（2015）12-2097-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.12.009

2015-08-13）

江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ12479）