利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系

方佳萍，赵秀娟，齐艳，王玺，吴旭东△，娄建石

利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系

方佳萍1,2，赵秀娟3，齐艳4，王玺3，吴旭东3△，娄建石1△

目的利用CRISPR/Cas9n系统在NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系中敲除Asxl2基因。方法设计一对靶向小鼠Asxl2基因第5个外显子的小向导RNA（sgRNA），分别克隆进pX462载体。将测序鉴定正确的重组质粒转染至NIH3T3细胞中，利用有限稀释法得到单细胞，通过培养获得单克隆细胞系。提取单克隆细胞系基因组DNA，ge⁃notyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序。利用Western blot方法检测细胞株中Asxl2的敲除效果。结果成功构建靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒。将2个重组质粒共转染NIH3T3细胞，嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系，并且经genotyping PCR测序验证得到一株正确的单克隆细胞系。Western blot证实敲除Asxl2后，该NIH3T3细胞系中Asxl2蛋白表达缺失。结论通过这个系统得到了靶向Asxl2的CRISPR/Cas9n重组质粒及稳定敲除Asxl2的NIH3T3细胞系。

ASXL2；CRISPR/Cas9n；CRISPR系统；表观遗传

果蝇Asx（Additional sex combs）基因最初是通过PcG（Polycomb group）样的突变表型和与PcG基因的相互作用被鉴定出来的［1-2］，是ETP（Enhancers of trithorax and Polycomb）基因的一种［3］，能调节或招募Polycomb抑制复合体（Polycomb-group repressor complex，PRC）和trithorax激活复合体（trithoraxgroup activator complex），在不同的状态下起到调节转录激活和转录抑制的双重作用［4-6］。果蝇Asx基因

在哺乳动物中有3个同源基因，分别为Asxl1、Asxl2和Asxl3，其中Asxl2基因在2003年由Katoh等［7］鉴定出来。本研究利用CRISPR（Clustered regularly in⁃terspaced short palindromic repeats）/Cas（CRISPR-associated）9n系统建立Asxl2基因靶向敲除系统，并获得Asxl2基因稳定敲除的NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系，以期为进一步研究Asxl2基因的功能及作用机制提供细胞模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞CRISPR/Cas9n质粒pSpCas9n（BB）-2A-Puro（pX462）及NIH3T3细胞由本实验室保存。感受态细菌trans5α购自北京全式金公司。质粒图谱可于http:// www.addgene.org网站查询。

1.1.2 酶类及主要试剂Fast Digest BbsⅠ、FastAP、10×Fast Digest Buffer（Green）购自Fermentas公司；T4 PNK、T4 ligase、10×T4 Ligation Buffer、10 mmol/L ATP购自NEB公司；Plas⁃mid Safe exonuclease、10×Plasmid Safe Buffer购自Epicentre公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；质粒大量提取试剂盒购自QIAGEN公司；Lipo2000转染试剂购自Invitrogen公司；Opti-MEM培养基购自Gbico公司；兔源Asxl2抗体由丹麦Biotech Research and Innovation Centre的Kristian Helin教授馈赠；鼠源β-actin抗体、辣根过氧化物酶标抗鼠IgG购自CST公司。

1.1.3 其他基因测序工作由华大科技公司完成。小向导RNA（sgRNA）寡链核苷酸（oligo）DNA序列由苏州金唯智生物科技有限公司北京分公司合成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA oligo序列的设计应用http：//crispr.mit.edu/网站设计一对针对Asxl2 cds区第5个外显子的sgRNA序列，见图1。设计方法如下：（1）根据NCBI发布的mAsxl2 cds区序列，在起始密码子后面寻找大约200 bp富含NGG的序列，提交至该网站。（2）根据网站提交的结果，选择分数较高的一对序列，在其两端加上酶切位点。在每条sgRNA序列F链的5′端添加CACC，R链的5′端添加AAAC，与pX462质粒经Fast Digest BbsⅠ酶切后形成的黏性末端互补。如F链的5′端第一个碱基不是G，则在5′端CACC后面添加一个G，相应地R链的3′端再增加一个C，见表1。以下将2个pX462重组质粒分别称为pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2。

Tab.1The sequences of mAsxl2 sgRNA oligo表1 mAsxl2 sgRNA oligo序列

在oligo序列两端添加的碱基用加粗斜体并下划线表示

1.2.2 重组质粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2的构建与鉴定pX462为含U6启动子的sgRNA骨架表达载体，表达具有Cas9 D10A切口酶突变的Cas9n，带有氨苄青霉素和嘌呤霉素抗性。用Fast Digest BbsⅠ对pX462进行酶切，DNA凝胶电泳后回收线性化的载体。用T4 PNK分别对oligo1、oligo2进行磷酸化和退火。用T4 ligase将线性的pX462质粒载体分别与退火后的oligo1、oligo2室温连接1 h。连接产物转化感受态细菌trans5α，在氨苄抗性的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆摇菌，送测序。测序引物为U6启动子的正向引物序列，5′-ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATA-3′。测序正确的克隆提取重组质粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2。

1.2.3 细胞转染和单克隆细胞的获得将Lipo2000转染试剂和Opti-MEM混合，重组质粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2分别与Opti-MEM混合，室温孵育5 min。再将Lipo2000转染试剂混合物与重组质粒混合物混合，室温孵育20 min。消化NIH3T3细胞，按一定密度接种于6孔板中，加入孵育完的转染试剂、重组质粒混合物。转染8 h后换液，48 h后加入嘌呤霉素筛选。筛选48 h后消化细胞，用有限稀释法将细胞按一定密度接种于96孔板中，获得单细胞。

1.2.4 单克隆细胞系genotyping PCR测序鉴定培养1周后，将单克隆细胞接种到24孔板，得到8株单克隆细胞系。其中5#和8#生长状态比较好，分别命名为Asxl2 ko（knock out）5#和Asxl2 ko 8#。培养1周左右收集细胞，提取基因组DNA，在重组质粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2靶向的位点上、下游设计引物，见表2，进行PCR，PCR产物DNA凝胶电泳后回收，送测序。

Tab.2The sequences of mAsxl2 genotyping PCR and RT-qPCR primer表2 mAsxl2 genotyping PCR及RT-qPCR引物序列

1.2.5 Western blot检测Asxl2的表达收集野生型NIH3T3细胞和测序正确的单克隆细胞，用RIPA裂解细胞，收集全细胞提取物，离心取上清作为样品，用野生型的NIH3T3细胞的细胞裂解液作对照。测定样品蛋白浓度，取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，经湿转印至NC膜后，5%脱脂牛奶封闭，一抗、二抗孵育，加入曝光底物进行曝光。以β-actin为内参，Western blot法检测Asxl2蛋白在细胞中的表达情况，比较野生型细胞和Asxl2敲除细胞中Asxl2蛋白的表达差异。

1.2.6 RT-qPCR检测Asxl2的表达收集野生型NIH3T3细胞和测序正确的单克隆细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，去除基因组DNA，再逆转cDNA。设计Asxl2 RT-qPCR引物，见表2，进行RT-qPCR。rpo作为内参，检测Asxl2在细胞中的表达情况，比较野生型细胞和Asxl2敲除细胞中Asxl2的表达差异。

1.3 统计学方法采用SPSS统计软件进行分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒pX462-Asxl2-1和pX462-Asxl2-2的测序重组质粒基因测序结果显示，在酶切位点之间插入的片段位置、方向及序列与预期一致，证实oligo1、oligo2正确插入pX462，重组质粒构建成功。

2.2 单克隆细胞株genotyping PCR片段测序的结果将Asxl2 ko 5#和Asxl2 ko 8#的测序结果与mAsxl2的全基因组序列比对，发现Asxl2 ko 5#的靶位点附近发生了缺失，并且在靶位点的下游发生了很多点突变，见图2。Asxl2 ko 5#测序结果的峰图显示，靶位点附近有杂峰，见图3A。因此Asxl2 ko 5#的靶位点附近没有发生有意义的插入或缺失突变。Asxl2 ko 8#在靶位点处插入了一段片段，见图2。Asxl2 ko 8#测序结果的峰图显示，靶位点附近均为单一峰，测序结果良好，见图3B，Asxl2 ko 8#在靶位点上成功引入插入突变。

2.3 Western blot检测Asxl2蛋白敲除的效果相比于野生型NIH3T3细胞，Asxl2 ko 5#单克隆细胞内源性Asxl2蛋白表达量下降，但仍有表达。Asxl2 ko 8#单克隆细胞内源性Asxl2蛋白几乎完全没有表达，与测序结果一致，见图4。

Fig.4Western blot analysis of Asxl2图4 Western blot检测Asxl2蛋白表达水平结果

2.4 RT-qPCR检测Asxl2基因表达的变化相比于野生型NIH3T3细胞，Asxl2 ko 8#单克隆细胞Asxl2基因表达降低（1.000±0.034 vs 0.377±0.008，t= 31.031，P＜0.01）。

3 讨论

3.1 CRISPR/Cas9n技术基因打靶技术是一种重要的分子技术研究手段。CRISPR/Cas9n系统是新一代的基因定向编辑技术，相比于锌指核酸内切酶（zinc finger endonuclease，ZFN）和类转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator-like effector nu⁃clease，TALEN）等经典的基因打靶技术，具有操作简单、制备周期短、精确高效等优点［8］。自该技术报道以来，CRISPR/Cas9n系统已经被运用于构建基因敲除细胞系［9］和动物模型［10］。Cas9核酸内切酶可以通过sgRNA引导，靶向基因序列的特异性位点，并切割带有5′-NGG的PAM区的靶位点。Cas9核酸内切酶有HNH和RuvC两个活性位点，分别在互补和非互补链上切割。互补链切割的位点位于PAM区的5′端的第三个碱基外侧，非互补链切割的位点在PAM区上游的3～8 bp碱基之间，制造出双链DNA断裂。断裂的DNA在修复过程中会启动同源重组和非同源末端连接，导致DNA链发生突变，在断裂的位点处插入或缺失部分片段［11］。CRISPR/Cas9n的特异性仅与sgRNA配对的靠近PAM区处7～12 bp碱基相关，sgRNA有可能会识别与靶序列存在几个核苷酸差异的DNA片段，产生脱靶效应［12］。Ran等［13］将Cas9在RuvC催化位点进行突变，改造为在sgRNA互补链制造单链切口的切口酶（Cas9n），由一对sgRNA分别引导来实现靶定切割位点，显著降低了脱靶效应，使CRISPR/Cas9n系统的精确度更高。

另外，CRISPR技术在医学方面也有很大的应用潜力。Kennedy等［14］利用CRISPR系统选择性地破坏乳头瘤病毒（HPV）基因，诱导肿瘤的坏死。Yin等［15］利用CRISPR技术治愈了因单一遗传突变而患有罕见肝病的小鼠。相信CRISPR技术在未来会有更广阔的发展前景。

3.2 Asxl2基因研究现状从2003年Asxl2基因发现至今，越来越多的文章报道Asxl2基因与多种疾病相关，但是对其调控疾病发生发展的分子机制的研究尚不深入。Lai等［16-17］研究显示，Asxl2基因是心脏发育的重要调节因子，在哺乳动物心脏中高表达并且用来维持心血管功能。McGinley等［18］研究发现，Asxl2基因缺失对小鼠有胚胎致死性，Asxl2-/-小鼠心脏会表现出心脏功能的持续性减退，出现左心室增厚，房间隔缺损等，表现出先天性心脏病的症状。Nakahata等［19］研究发现，在某些成人T细胞淋巴瘤中会观察到der（10）t（2；10）（p23；p11.2）发生易位，使EPC1（enhancer of polycomb 1）基因和Asxl2基因发生融合，导致这两个蛋白功能的紊乱，引起疾病的异常表现。此外，在前列腺癌［20］、胰腺癌［21］、乳腺癌［22］和白血病［23］中都可以观察到Asxl2基因的突变。

利用本研究构建的Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系，为将来深入研究Asxl2基因的功能及作用机制提供了工具。

（图1～3见插页）

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（2015-01-30收稿 2015-06-03修回）

（本文编辑 李鹏）

Construction of Asxl2 gene knock out stable NIH3T3 cell line with CRISPR/Cas9n system

FANG Jiaping1,2，ZHAO Xiujuan3，QI Yan4，WANG Xi3，WU Xudong3△，LOU Jianshi1△
1 Department of Pharmacology，College of Basic Medical，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Community Health Service Center，Xiaobailou Street，Heping District；3 Deparment of Cell Biology，College of Basic Medical，Tianjin Medical University；4 Tianjin Medical University Eye Hospital△

ObjectiveTo knock out Asxl2 gene in murine embryonic fibroblast cell line NIH3T3 using CRISPR/Cas9n system.MethodsA pair of sgRNAs which targeted exon 5 of Asxl2 gene were designed and subcloned into the pX462 vec⁃tor.The recombined plasmids were verified by sequencing and transfected into NIH3T3 cell line.Single cells were isolated through serial dilutions,followed by an expansion period to obtain new monoclonal cell lines.The genomic DNA of the new monoclonal cell lines was extracted and a DNA fragment flanked the target site was amplified by genotyping PCR then se⁃quenced.Lastly,western blotting were applied to confirm whether Asxl2 was successfully knocked out.ResultsThe CRIS⁃PR/Cas9n plasmids that targeted Asxl2 were successfully constructed.NIH3T3 cells were co-transfected with the two recom⁃binant constructs.After puromycin selection,subclonal cell lines were obtained and one of them was validated by genotyping PCR-sequencing.Western blotting also confirmed that Asxl2 was completely depleted in the NIH3T3 cell line.ConclusionCRISPR/Cas9n plasmids that targeted Asxl2 were successfully constructed therefore a Asxl2 knockout NIH3T3 stable cell line was established via this system.

ASXL2；CRISPR/Cas9n；CRISPR system；epigenetic

R349.5

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.005

973国家重点基础研究发展计划——组蛋白甲基化酶调控NK细胞功能的机制与结构研究（2014CB910104）；天津市高等学校科技发展基金计划项目（093-201301）

1天津医科大学基础医学院药理学教研室（邮编300070）；2天津市和平区小白楼街社区卫生服务中心；3天津医科大学基础医学院细胞生物学系；4天津医科大学眼科医院

方佳萍（1986），女，硕士在读，初级药师，主要从事药理学和表观遗传调控研究

△通讯作者E-mail：wuxudong@tijmu.edu.cn；jianshilou@163.com