MicroRNA-21对肺成纤维细胞增殖和分化的影响

曹嫚，赵红，何军，戴利，殷小成，姚平波

MicroRNA-21对肺成纤维细胞增殖和分化的影响

曹嫚，赵红△，何军，戴利，殷小成，姚平波

目的探讨小鼠肺成纤维化细胞模型中microRNA（miR）-21对肺成纤维细胞增殖和分化的影响。方法24只SPF级C57BL/6小鼠随机分为假手术组和肺纤维化模型组，各12只。经气管内注入博莱霉素建立小鼠肺纤维化模型，采用荧光定量PCR检测各组肺组织miR-21的表达。提取小鼠成纤维细胞，胰酶消化，接种于6孔板，使细胞浓度达到30%～50%。设随机对照组、空白对照组和miR-21 mimic组。各组分别在50 μL Opti-MEM加入2.5 μL PBS、阴性对照储存液和miR-21 mimic储存液（20 μmol/L）。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖活性，蛋白质印迹法检测成纤维细胞含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS-1）和转化生长因子（TGF）-β1的表达。结果与假手术组比较，肺纤维化模型组小鼠肺组织中miR-21的表达量明显上调。与随机对照组和空白对照组比较，miR-21 mimic组成纤维细胞miR-21基因表达显著上调，成纤维细胞增殖率增加，ADAMTS-1蛋白表达明显下降，而TGF-β1表达显著上调；空白对照组与随机对照组ADAMTS-1及TGF-β1蛋白表达无明显差异。结论在小鼠肺成纤维化细胞模型中上调的miR-21可通过ADAMTS-1/TGF-β1信号通路促进肺纤维化。

肺纤维化；成纤维细胞；转化生长因子β1；微RNAs；细胞增殖；细胞分化；ADAMTS-1；microRNA-21

肺纤维化疾病的特征为肺间质过多的胶原及细胞外基质（ECM）沉积，是不同病因学所致肺部疾病的共同表型，因此研究如何改善肺纤维化后肺组织的修复能力具有重要的临床意义［1-2］。miRNA（miR）

是一类抑制靶基因的翻译过程并参与许多重要的生物学过程的非编码小分子RNA。研究表明miR-21在博莱霉素处理的小鼠肺内表达增加，抑制miR-21后肺纤维化程度明显减轻，过表达miR-21通过转化生长因子（TGF）-β1/Smad信号通路促进肺纤维化［3-4］。本研究成功复制肺纤维化模型，检测肺组织miR-21的表达情况，并利用miR-21的模拟物（miR-21 mimic）转染小鼠原代肺成纤维细胞，观察过表达miR-21对肺成纤维细胞增殖与分化的影响，为肺纤维化的发病机制和筛选出关键miRNA作为肺纤维化疾病的治疗靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料（1）实验动物。SPF级C57BL/6小鼠24只，雄性，体质量20～26 g，由南华大学实验动物部提供。（2）试剂和仪器。RNA反转录试剂盒和SYBR试剂、脂质体2000、实时荧光定量PCR仪均购自瑞士罗氏公司；DMEM培养基购自Sigma-Aldrich美国公司；胎牛血清（FBS，20%）购自Gibco美国公司；化学修饰的miR-21 mimic、蛋白提取试剂盒、CCK-8细胞增殖检测试剂盒均购自广州市锐博生物科技有限公司；兔抗鼠含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（a distintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs，ADAMTS-1）多克隆抗体、TGF-β1单克隆抗体及HRP-标记的羊抗兔二抗及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组按照随机数字表法分为假手术组和肺纤维化模型组，每组12只，均为普通饲料饲养，自由饮水。2组小鼠体质量分别为（23±3）、（24±2）g，组间差异无统计学意义（t=0.961，P=0.347）。

1.2.2 小鼠肺纤维化模型的建立以1%氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，无菌操作下钝性分离暴露气管，气管内一次性注入博莱霉素生理盐水溶液0.2～0.5 mL（5 mg/kg），注射后将小鼠直立并旋转，假手术组在相同条件下给予生理盐水。

1.2.3 动物模型制备及鉴定1%氯胺酮100 mg/kg麻醉处死，去除结缔组织，截取肺组织，迅速放入-80℃液氮中冻存备用，用于提取肺组织总RNA。然后取右肺上叶置体积分数为40 g/L甲醛中固定24 h以上，石蜡包埋、切片。分别行微波改良Masson三色法、VG染色法。

1.2.4 miR-21的检测（1）肺组织总RNA提取与定量。用TRIzol法提取肺组织总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，紫外分光光度计测定总RNA浓度及纯度。（2）反转录。按照miScriptⅡ反转录试剂盒说明，经反转录合成cDNA。总反应体系20 μL，反应条件为孵育37℃60 min，95℃5 min。并使用无酶水稀释后-70℃冰箱保存备用。（3）qRT-PCR。引物由MRC Gene公司设计合成，按照miScript SYBR Green Kit说明配制反应混合物，每个反应体系为10 μL，使用罗氏LightCycler480/荧光定量PCR仪检测，反应条件：95℃30 s预变性；95℃5 s，60℃30 s，重复40个循环进行扩增反应；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s制备融解曲线。每个样品设3个复孔。采用标准曲线法计算mRNA表达量，并计算其相对表达量（U6和β-actin校正值）。具体操作参照说明书。引物序列见表1。

Tab.1The stem-loop and PCR primers of targeted genes表1 各基因引物序列

1.2.5 成纤维细胞的提取无菌条件下取出0.1 g肺组织于培养皿中，Hank's液漂洗，剪碎肺组织放入15 mL离心管中，加入5倍体积0.05%胰酶，37℃水浴6 min，反复吹打、静置，沉降后弃去上清液。沉淀加入约5倍体积0.08%胰蛋白酶及0.1%胶原酶Ⅱ混合液，反复吹打15 min，离心取沉淀后以15 mL胎牛血清的DMEM培养液重悬，接种于6 cm培养皿中。每隔60～90 min后更换新鲜胎牛血清的DMEM培养液。

1.2.6 miR-21 mimic的转染转染前24 h，胰酶消化成纤维细胞，接种到6孔板中，使转染前细胞浓度达到30%～50%。实验设随机对照组、空白对照组和miR-21 mimic组（均n= 5）。各组分别在50 μL Opti-MEM加入2.5 μL PBS、阴性对照储存液和miR-21 mimic储存液（20 μmol/L），常温孵育5 min。用50 μL Opti-MEM稀释1 μL lipo2000，温和混匀并恒温孵育5 min。将以上两液体温和混匀，室温孵育20 min。将混合液加入含有细胞1 mL培养基的培养孔中，柔和混匀，培养5 h后，将孔中含mimic-lipo2000混合液的培养基移去，替换新鲜胎牛血清的DMEM培养液。细胞培养1 d，采用荧光定量PCR技术检测miR-21的含量。

1.2.7 Western blot法测定成纤维细胞ADAMTS-1及TGF-β1蛋白的表达肺原代成纤维细胞培养1周后，按试剂盒说明提取蛋白，并测定蛋白浓度。10%SDS-PAGE行电泳及PVDF膜转印3 h。电泳结束后用半干转电转移法将凝胶中蛋白转至硝酸纤维素膜。转膜后将膜置于5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入人一抗（1∶100、1∶750稀释）4℃孵育过夜，采用ECL显色。凝胶成像系统扫描分析，PhotoshopCS 5.0软件测定各组灰度值，分别以ADAMTS-1、TGF-β1与GAPDH显影条带灰度值的比值表示相对表达水平。实验重复3次。

1.2.8 CCK-8检测成纤维细胞的增殖取对数生长期成纤维细胞，以每孔细胞数量2×107/L密度接种于96孔板（100 μL/L）中，预培养后，每孔加入15 μL CCK-8溶液，饱和湿度孵育箱中培养2 h，上酶标仪测定460 nm处的吸光度（A460）。通过以下公式计算增殖率：增殖率（%）=［1-（miR-21 mimic组A460-对照组A460）/对照组A460］×100%。

1.3 统计学方法应用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差表示，2组间比较采用t检验，

多组间比较采用单因素方法分析，组间多重比较行LSD-t检验；相关分析采用Pearson相关。计数资料组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺纤维化的形态结构假手术组肺泡结构正常，极少炎性细胞浸润。肺纤维化模型组肺结构紊乱，肺泡间隔内成纤维细胞明显增多，纤维组织增生，呈条索样、斑片状分布，肺泡间隔破坏，微波改良Masson染色可见大量染成绿色的胶原纤维，胶原纤维增生明显，表明肺纤维化模型复制成功，见图1。

Fig.1Histopathological changes of lung tissue between two groups（Microwave modified Masson staining，×100）图1 2组大鼠肺组织病理改变（微波改良Masson染色，×100）

2.2 miR-21基因的表达肺纤维化模型组miR-21基因的表达量为（6.05±0.24）×10-4，明显高于假手术组的（1.62±0.45）×10-4（n=12，t=12.20，P＜0.01）。

2.3 成纤维细胞中miR-21基因表达及增殖率比较miR-21 mimic组成纤维细胞中的miR-21基因表达及增殖率均明显高于随机对照组和空白对照组（P＜0.05），而后两组组间差异无统计学意义，见表2。

Tab.2Comparison of gene expression of miR-21 and proliferation in fibroblast between control group，blank group and miR-21 group表2 成纤维细胞miR-21基因表达及增殖率比较（n=5，）

Tab.2Comparison of gene expression of miR-21 and proliferation in fibroblast between control group，blank group and miR-21 group表2 成纤维细胞miR-21基因表达及增殖率比较（n=5，）

＊＊P＜0.01；a与随机对照组比较，b与空白对照组比较，P＜0.05

增殖率（%）12.48±1.23 13.98±1.61 27.89±1.66ab 32.62＊＊组别随机对照组空白对照组miR-21 mimic组F miR-21/U6（×10-4）1.14±0.07 1.03±0.20 4.87±0.71ab 14.82＊＊

2.4 ADAMTS-1及TGF-β1蛋白表达水平的变化与随机对照组和空白对照组相比，miR-21 mimic组ADAMTS-1蛋白的表达明显下调，条带灰度减弱；而TGF-β1蛋白的表达显著上调，条带灰度增强；空白对照组与随机对照组ADAMTS-1及TGF-β1蛋白表达无明显差异，见图2。

Fig.2The expressions of ADAMTS-1 and TGF-β1in fibroblast between three groups shown by Western blot图2 Western blot检测肺成纤维细胞ADAMTS-1和TGF-β1蛋白的表达情况

3 讨论

肺纤维化是由多因素所致的慢性、渐进性、致命性肺间质性疾病，以成纤维细胞过度分化增殖、ECM胶原蛋白过度积聚、瘢痕组织形成引起肺结构不可逆破坏为特征［5］。大量研究表明TGF-β1是公认最关键的诱导肺纤维化的调控因子，使成纤维细胞过度增殖分化，ECM在肺间质过度积聚，促进肺纤维化的发生和发展［1］。ADAMTS-1是ADAMTS金属蛋白酶家族的第一个成员，成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等细胞可产生ADAMTS-1，ADAMTS-1分泌后通过C末端3个血小板结合蛋白基序和间隔区锚定在ECM中，参与ECM蛋白的调控［2］。文献报道miRNA参与肺纤维化过程中肌成纤维细胞增殖分化的病理过程［6］。单编码基因miR-21是进化上高度保守的miRNA，与ADAMTS-1存在靶向结合作用［6-7］。研究表明在博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型和肺纤维化患者肺组织中，miR-21主要在肌成纤维细胞集中表达并上调［7］。本研究成功复制大鼠肺纤维化模型，微波改良Masson染色可见大量染成绿色的胶原纤维，胶原纤维增生明显。qRT-PCR结果发现miR-21在小鼠肺纤维化模型组表达较假手术组显著上调，提示miR-21参与肺纤维化后肺损伤和修复过程。

成纤维细胞的增殖与分化在肺纤维化过程中扮演重要角色。研究表明miR-21在博莱霉素处理的小鼠体内及特发性肺纤维化患者肺内表达均增加，抑制miR-21后肺纤维化程度明显减轻。miR-21在纤维化组织中表达上调是通过TGF-β1/Smad信号通路实现的，TGF-β1可以通过增强miR-2l的转录及转录后加工使其表达上调［8］。本研究证实：过表达miR-21可明显激活成纤维细胞的增殖和分化，提示miR-21与肺纤维化的发生、发展密切相关。ADAMTS-1基因是TGF-β1信号转导通路的抑制蛋白，其可与细胞膜上TGF-β1受体竞争性结合，阻断TGF-β1信号在胞浆内的传导，下游信号紊乱是TGF-β1信号转导通路失活的机制之一。而抑制TGF-β1/ADAMTS-1信号通路可以减轻博莱霉素导致的肺纤维化。笔者预测ADAMTS-1为miR-21

的下游靶基因，本研究结果显示，在成纤维细胞中过表达miR-21可以明显抑制ADAMTS-1的表达，提示在小鼠肺纤维化模型下，miR-21可以通过抑制ADAMTS-1的表达，进而促进TGF-β1对成纤维细胞的分化而导致肺纤维化。

综上所述，在小鼠肺纤维化模型中，miR-21在肺纤维化组织中的表达明显上调，通过抑制靶基因ADAMTS-1的表达，促进成纤维细胞的增殖和分化而导致肺纤维化，为有效预防肺纤维化提供了新的线索和治疗分子靶点。

［1］Dong SS，Zhang P，Zhao H,et al.ADAMTS-1 influence expres⁃sion of type 1 collagen in vitro［J］.China Journal of Modern Medi⁃cine,2014,24（2）:40-43.［董素素，张平,赵红，等.ADAMTS-1对小鼠肺成纤维细胞I型胶原蛋白的影响［J］.中国现代医学杂志, 2014,24（2）:40-43］.

［2］Liu LJ,Zhang P，Zhao H.Study of inhibitory effects of resveratrol on pulmonary fibrosis through TGF-β1/ADAMTS-1 signaling path⁃way［J］.Chinese Pharmacological Bullrtin,2013,29（3）:425-431.［刘理静，张平，赵红.白藜芦醇通过ADAMTS-1/TGF-β1信号通路抑制肺纤维化［J］.中国药理学通报,2013,29（3）:425-431］.

［3］Gao Y,Lu J,Zhang Y,et al.Baicalein attenuates bleomycin-induced pulmonaryfibrosisinratsthroughinhibitionofmiR-21［J］.PulmPhar⁃macolTher,2013,26（6）:649-654.doi:10.1016/j.pupt.2013.03.006.

［4］Honeyman L,Bazett M,Tomko TG,et al.MicroRNA profiling impli⁃cates the insulin-like growth factor pathway in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice［J］.Fibrogenesis Tissue Repair,2013,6（1）:1-10.doi:10.1186/1755-1536-6-16.

［5］Wang SS,Fan JJ,Ni CH.Progress in research of the miRNA and pulmonary fibrosis［J］.Chin J Ind Hyg Occup Dis,2013,31（5）:398-400.［王莎莎，范晶晶，倪春辉.肺纤维化与microRNA研究进展［J］.中华劳动卫生职业病杂志,2013,31（5）:398-400］.

［6］Li P,Li J,Chen T,et al.Expression analysis of serum microRNAs in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Int J Mol Med,2014,33（6）: 1554-1562.

［7］Li P,Zhao GQ,Chen TF,et al.Serum miR-21 and miR-155 expres⁃sion in idiopathic pulmonary fibrosis［J］.J Asthma,2013,50（9）: 960-964.doi:10.3109/02770903.2013.822080.

［8］Patrick DM,Montgomery RL,Qi X,et al.Stress-dependent cardiac remodeling occurs in the absence of microRNA-21 in mice［J］.J Clin Invest,2010,120:3921-3916.

（2014-12-15收稿 2015-04-16修回）

（本文编辑 陈丽洁）

Effect of microRNA-21 on proliferation and differentiation of pulmonary fibroblasts of mice

CAO Man，ZHAO Hong△,HE Jun,DAI Li,YIN Xiaocheng,YAO Pingbo
Pediatrics of the Affiliated Nanhua Hosital of University of South China，Hengyang 421001，China△

ObjectiveTo investigate the effect of microRNA（miR）-21 on proliferation and differentiation of murine pulmonary fibroblasts.MethodsC57BL/6 mice of SPF grade（n=24）were randomly divided into Sham group and Pulmo⁃nary fibrosis model group with 12 mice in each group.Pulmonary fibrosis model was established by trans-tracheal jet ventila⁃tion of bleomycin into mice.The transcription levels of miR-21 were examined by quantitative real-time PCR in various pul⁃monary fibrosis tissues.Primary fibroblast were isolated and digested by Trypsin then inoculated into 6 well plate to reach confluence of 30%-50%.PBS（2.5 μL）,negative control stock solution and miR-21 mimic stock solution（20 μmol/L）were added into Opti-MEM（50 μL）as control group,blank group and miR-21 mimic group respectively.The cell viability was as⁃sessed by CCK-8.Expressions of ADAMTS-1 and TGF-β1in the pulmonary fibroblasts were tested using Western blot.ResultsThe expression of miR-21 was significantly increased in lungs of mice in pulmonary fibrosis model group than that in sham group.Expression of miR-21 was higher in miR-21 mimic group than that in control group and blank group.Expres⁃sion of miR-21 was significantly higher with better cell viability in miR-21 mimic group than that in control group and blank group.The expression of ADAMTS-1 was significantly decreased in miR-21mimic group,while the expression of TGF-β1,a target gene of miR-21,was significantly increased in miR-21 mimic group compared with the other two groups.There is no significant different in expressions of ADAMTS-1 and TGF-β1between control group and blank group.ConclusionOver⁃expression of miR-21 in pulmonary fibroblasts disrupts TGF-β1signaling pathway by reducing expression of ADAMTS-1, which promotes the proliferation and differentiation of pulmonary fibroblast.

pulmonary fibrosis；fibroblasts；transforming growth factor beta1；microRNAs；cell proliferation；cell differ⁃entiation；ADAMTS-1；microRNA-21

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.014

湖南省自然科学基金资助项目（14JJ7044）；湖南省教育厅青年项目（14B156）

湖南衡阳，南华大学附属南华医院儿科（邮编421001）

曹嫚（1981），女，主治医师，硕士，主要从事呼吸系统肺间质性疾病研究

△通讯作者E-mail：zhaohong779900@sina.com