生物活性玻璃促进早期釉质龋再矿化最适浓度的研究

方谦，周雪，穆玉，陈乃玲，赵艳萍，刘庆辉，彭伟

生物活性玻璃促进早期釉质龋再矿化最适浓度的研究

方谦，周雪，穆玉，陈乃玲，赵艳萍，刘庆辉，彭伟△

目的探讨生物活性玻璃促进早期釉质龋再矿化的最适浓度。方法收集新鲜拔除的牛切牙，制备釉质标本，随机分成显微硬度组和荧光组两大组，每组又分为3%、6%和9%小组，每小组5个标本。所有标本放在37℃人工脱矿液中脱矿72 h后，分别浸泡在质量分数为3%、6%和9%生物活性玻璃溶液内，5 min/次，2次/d，循环15 d。显微硬度仪测量脱矿前后及再矿化后牙釉质表面的显微硬度，并计算再矿化前后的显微硬度差值。荧光显微镜观察早期釉质龋表层下的荧光带厚度，从而评价再矿化效果。结果6%组的显微硬度差值最高，3%组的差值最低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。6%组脱矿深度差值大于3%和9%组（均P＜0.05），3%和9%组的脱矿深度差值差异无统计学意义。结论质量分数为6%的生物活性玻璃溶液是促进早期釉质龋再矿化的最适浓度，对早期釉质龋再矿化效果最理想。

龋齿；牙釉质；牙再矿化；早期釉质龋；生物活性玻璃；显微硬度

早期龋的发生是牙釉质脱矿与再矿化交替进行的动态过程。防治早期龋的关键是使脱矿过程向再矿化过程转变。目前临床上应用广泛的防龋材料主要有氟化物、窝沟封闭剂和渗透性树脂等。而生物活性玻璃是一种新型安全有效的再矿化制剂，它由多种无机离子组成，且具有优良的生物相容性和成骨活性，其中45S5为第三代生物玻璃，它广泛用于牙体硬组织的修复［1-2］。相关研究证实了以生物活性玻璃为主要成分的奥乐V护牙剂、Mirawhite tc和Nanosentivhca等产品能够促进脱矿釉质再矿化［3-4］，但其促进釉质再矿化的最适浓度鲜见报道。本研究观察不同浓度的生物活性玻璃促进早期釉质龋再矿化的效果，以寻求最适浓度，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器质量分数为3%、6%、9%的生物活性玻璃溶液（45S5，北京大清生物技术有限公司）。人工脱矿液配方：2.2 mmol/L硝酸钙，2.2 mmol/L磷酸二氢钾，50 mmol/L冰醋酸，pH值4.5。人工唾液配方（ISO/TR10271标准）：氯化钠0.4 g，氯化钾0.4 g，无水氯化钙0.795 g，磷酸二氢钠0.78 g，硫化钠0.005 g，尿素1 g，去离子水稀释至1 000 mL，pH值7.0。0.1 mmol/L罗丹明B染液（天津市光复精细化工研究所）；HVST-1000ZA显微硬度计（研润光机）；荧光显微镜（日本，OLYMPUS）；DH-250型电热恒温培养箱（北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 离体牛牙收集和处理选择新鲜拔除的牛切牙，从中选取釉质发育良好，无脱钙、无龋坏、无划痕和裂纹牛牙30颗，冠根分离，低速双面金刚砂片切轮切成15块5 mm×5 mm×2 mm大小釉质块作为硬度组样本和15块10 mm×8 mm×3 mm大小釉质块作为荧光组样本，流水下用600、800、1 000、1 200、2 400目碳化硅砂纸依次抛光唇侧釉质面。备用标本存于4℃去离子水中保存。

1.3 方法

1.3.1 实验分组用简单随机抽样法中的抽签法将30块釉质块分成硬度组和荧光组，每组又按上述随机抽样法分成3%、6%和9%3个浓度组，各5个样本。每组用不同颜色的抗酸指甲油标记，用显微硬度计测量硬度组正常釉质表面的显微硬度（SMH）。脱矿前除釉质面外均涂上双层抗酸指甲油。

1.3.2 早期釉质龋模型的建立将釉质块浸泡在37℃人工脱矿液中72 h，用去离子水冲洗釉质块1 min。荧光组样本在釉质面一侧涂上双层抗酸指甲油，分为脱矿区和再矿化区。用显微硬度计测量硬度组脱矿后釉质表面的显微硬度（SMH1）。

1.3.3 再矿化处理脱矿液中浸泡10 min，再矿化液中（3%、6%和9%生物活性玻璃溶液）浸泡5 min，人工唾液中浸泡8 h，脱矿液中浸泡10 min，再矿化液中（3%、6%和9%生物活性玻璃溶液）浸泡5 min，人工唾液中浸泡过夜。循环15 d，在37℃电热恒温培养箱中进行。浸泡后用去离子水冲洗牙面1 min。

1.3.4 显微硬度计测量釉质的显微硬度应用显微硬度计测量再矿化后釉质表面的显微硬度值（SMH2），负荷1.961 N，作用10 s，每个标本分别选取釉质中央及距中央2 mm处测量3个点，取平均值，计算显微硬度差值（△SMH=SMH2-SMH1）。

1.3.5 荧光显微镜观察牛牙釉质的脱矿深度循环结束后取出标本，在脱矿区和再矿化区分别切取0.3 mm厚的切片，再将切片置于载玻片上，吸取0.1 mmol/L新鲜配置罗丹明B溶液滴于标本表面，以全部覆盖切片为准，将载玻片置于湿盒内，在37℃恒温培养箱内放置1 h。取出标本，大量去离子水缓冲牙面，切片干燥后置显微镜下×4倍观察脱矿区和再矿化区荧光渗入情况，用cellsens软件测量脱矿区和再矿化区荧光带的厚度。每个标本分别选取荧光带中央处及距中央处3 mm处测3个点，取平均值，算出脱矿深度差值（脱矿后深度-再矿化后深度）。

1.4 统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件进行统计处理。计量资料数据以均数±标准差表示。再矿化前后指标的比较选用配对t检验，多组间比较选用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度组釉质标本显微硬度检测结果脱矿前数据显示所选标本的硬度值符合正常牙釉质的硬度值。不同浓度组内再矿化后的显微硬度值均大于脱矿后（均P＜0.05）；各浓度组间△SMH比较差异有统计学意义（P＜0.05），6%组最高，9%组次之，3%组最低,差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

Tab.1The measurement results of the enamel SMH before and after remineralization in each group表1 各组釉质脱矿与再矿化后SMH的测量结果（n=5，MPa,）

Tab.1The measurement results of the enamel SMH before and after remineralization in each group表1 各组釉质脱矿与再矿化后SMH的测量结果（n=5，MPa,）

＊P＜0.05；a与3%组比较，b与6%组比较，P＜0.05；表2同

脱矿后90.56±33.23 68.88±23.01 59.44±15.35 t组别3% 6% 9% F 11.100＊20.084＊16.117＊脱矿前286.66±25.36 283.50±32.44 294.03±29.84再矿化后136.59±40.27 171.16±32.18 131.95±23.27△SMH 46.03±14.36 102.28±17.64a72.50±18.55ab32.257＊

2.2 不同浓度组釉质标本荧光显微镜观察分析结果不同浓度组内再矿化后的脱矿深度均小于脱矿后的深度（均P＜0.05）。6%组脱矿深度差值大于3%和9%组（均P＜0.05），3%和9%组的脱矿深度差值比较差异无统计学意义，见表2。早期釉质龋模型经过不同浓度生物活性玻璃处理后的再矿化区的荧光带的厚度均较脱矿区缩窄，6%组较3%、9%组的荧光带的厚度缩窄，见图1。

Tab.2The measurement results of the enamel depth before and after remineralization in each group表2 各组釉质脱矿与再矿化后脱矿深度的测量结果（n=5，μm，）

Tab.2The measurement results of the enamel depth before and after remineralization in each group表2 各组釉质脱矿与再矿化后脱矿深度的测量结果（n=5，μm，）

脱矿后深度266.72±65.01 293.89±35.38 228.94±19.37组别3% 6% 9% F再矿化深度215.10±80.18 170.07±26.52 171.26±30.44 t 5.882＊24.187＊8.367＊脱矿深度差值51.62±15.20 123.82±8.87a 57.67±11.93b 31.925＊

3 讨论

早期釉质龋的临床特征是呈白垩色且无牙体硬组织的破坏。白垩色的完全矿化时间与年龄有关，年轻人4 d内实现，老年人则需16 d，因此本实验选用的再矿化时间为15 d。牛牙与人牙的理化性能相似，且其对致龋模型的反应与人牙釉质相同；而且牛

牙取材方便，面积较大,因而被广泛使用。虽然牛牙釉质龋的表现为表层下脱矿，但因牛牙与人牙结构和化学组成成分的差异导致相同条件下两者的矿物丢失量的比率和脱矿深度的比率不同［5］，从而造成牛牙脱矿后的显微硬度值较人牙低。

Fig.1Difference of surface depth before and after remineralization（rhodamine×4）图1 各组脱矿与再矿化后釉质表层脱矿深度的观察结果（罗丹明×4）

Gjorgievska等［6］研究发现含羟基磷灰石和生物活性玻璃的牙膏均能高效地在釉质表面形成保护层，从而促进早期龋的再矿化。Milly等［7］发现生物活性玻璃溶液对脱矿釉质再矿化的效果优于其膏状物。王尹等［8］研究发现2%的生物活性玻璃溶液能够促进早期釉质龋再矿化。Gjorgievska等［4］用Mi⁃rawhite tc（含5.5%NovaMin）和Nanosentivhca（含7%NovaMin）处理脱矿后的牙釉质，发现这2种牙膏再矿化的效果无明显差别。因此本研究初期依次设定了2%～10%共9个浓度梯度，预实验发现2%的生物活性玻璃溶液促进釉质再矿化的效果不理想，3%、4%和5%组间、6%、7%和8%组间、9%、10%组间差异无统计学意义，本实验依据最低浓度原则选取了3%、6%和9%这3个浓度梯度。

显微硬度常用于牙体硬组织的检测，硬度值的变化反映了牙釉质中矿物质的得失。正常牙釉质的维氏硬度在242～339之间。显微硬度组的标本在实验前已简单随机分好组，测得的显微硬度值是标本自身脱矿前后及再矿化后的值，所得的显微硬度差值更具有说服力。再矿化前后的显微硬度差值越高，说明再矿化程度越高，本研究显示6%组的显微硬度差值较大。

共聚焦激光扫描显微镜也常用来检测再矿化效果，它的优点在于可对样本逐层扫描而不损伤样品，且能够定量分析牙釉质表面脱矿与再矿化的矿物质变化［9］。由于设备条件的限制，本实验根据荧光渗入原理采用荧光显微镜分析荧光渗入情况，利用自身所带的分析软件测量荧光带的厚度，但无法测定荧光面积和荧光量，所以是半定量分析。由图1及表2可知6%组再矿化能力最强。这可能与其所含的钙元素的浓度有关。矿化液中高浓度的钙离子能够加快钙和矿物质在釉质微孔中的沉积，但影响了钙离子向深层渗透，而低浓度的钙离子可渗透到龋损深层，利于矿化。生物活性玻璃与唾液接触后，颗粒中的钠离子与唾液中的氢离子置换，使溶液中的pH值升高，颗粒中的钙、磷酸根离子释放，与唾液中的钙磷离子沉积在脱矿釉质表面形成类羟基磷灰石，从而促进早期龋的再矿化［10］。由此可推测随着浓度的增加，生物活性玻璃溶液中的钙、磷离子在釉质表面沉积的同时可能部分渗入脱矿间隙中，从而促进脱矿釉质的再矿化；但达到一定浓度后，高浓度的生物活性玻璃溶液中的钙磷离子大部分沉积在釉质表面形成类羟基磷灰石，从而阻碍了钙、磷离子向脱矿区深层的渗入。

本实验通过对样本自身再矿化前后的对比，准确反映了不同浓度生物活性玻璃促进早期龋再矿化的效果。显微硬度仪和荧光显微镜的联合使用，保证了实验结果的可靠性。综上所述，生物活性玻璃促进早期釉质龋再矿化的最适浓度是6%。

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（2015-04-10收稿 2015-05-18修回）

（本文编辑 李国琪）

Optimizing concentration of bioactive glass that promotes early enamel caries remineralization

FANG Qian,ZHOU Xue,MU Yu,CHEN Nailing,ZHAO Yanping,LIU Qinghui,PENG Wei△
College of Stomatology，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China△

ObjectiveTo explore the optimum concentration of bioactive glass that promotes early enamel caries remineralization.MethodsFresh bovine incisors were selected and used for enamel specimen preparation.All specimens were randomly divided into two groups:micro hardness group and fluorescence group.Both groups were further divided into 3%,6%and 9%groups.These specimens were placed in containers with demineralization liquid at 37℃for 72 hours.Then they were treat with 3%,6%and 9%bioactive glass solution respectively twice a day for 5 minutes each.Samples in all three groups were dipped circularly into an artificial demineralization solution and an artificial saliva solution for 15 days.The mi⁃crohardness of enamel surface was measured before and after demineralization and remineralization.The different value of microhardness before and after remineralization was calculated.The thickness of fluorescence beneath the surface of early enamel caries was observed to evaluate the extend of remineralization effect.ResultsThe difference in value of micro hard⁃ness in 6%group was the highest while that in 3%group was the lowest.The differences were significant.The difference in value of demineralization depth in 6%group was greater than those in 3%and 9%groups（P＜0.05）.There was no statistical⁃ly significance between those in 3%group and 9%group.ConclutionThe optimum concentration of bioactive glass solu⁃tion that promotes the remineralization of early enamel caries is 6%,which is ideal for remineralization of early enamel caries.

dental caries；dental enamel；tooth remineralization；early enamel caries；bioactive glass；microhardness

R781.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.027

华北理工大学口腔医学院（邮编063000）

方谦（1988），女，硕士研究生，主要从事牙体牙髓病学研究

△通讯作者E-mail:pengwei1968@sina.com