三阴性乳腺癌中E-钙黏蛋白的表达及其临床意义

洪超群，庄轶轩，陈继明，吴 晓，张 凡

三阴性乳腺癌中E-钙黏蛋白的表达及其临床意义

洪超群，庄轶轩，陈继明，吴 晓，张 凡

目的 探讨三阴性乳腺癌组织中的E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)的表达及其与临床病理指标和预后的关系。方法 2002年1月—2008年10月在汕头大学医学院附属肿瘤医院接受治疗的女性三阴性乳腺癌组织35例，采用免疫组织化学GTvision两步法检测样本中E-cad的表达，采用卡方检验分析其与临床病理特征的关系，应用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型分析E-cad表达对预后的影响。结果 E-cad主要定位在细胞膜，35例三阴性乳腺癌组织中E-cad的低表达率为51.4%(18/35)，其表达与临床肿瘤分期(P＝0.009)和淋巴结转移有关(P＝0.044)。E-cad低表达和高表达患者总体生存曲线差异有统计学意义(Log-rank检验，P＝0.014)。Cox比例风险回归模型分析示E-cad是三阴性乳腺癌患者独立的预后因素(风险比0.241，95%置信区间0.072～0.814，P＝0.022)。结论 E-cad低表达或缺失更容易引起三阴性乳腺癌的浸润转移，在三阴性乳腺癌的发展过程中起着重要作用，可以作为三阴性乳腺癌患者预后的一个重要的独立预测因素。

E-钙黏蛋白；免疫组织化学；三阴性乳腺癌

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其中三阴性乳腺癌是指雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2均为阴性的乳腺癌，以恶性程度高、侵袭性强、化疗敏感及预后差为主要特征，占所有乳腺癌的10%～20%[1-2]。复发转移是乳腺癌患者的主要致死因素。E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-cad)是一种细胞黏附分子，具有维持组织结构完整性等作用，其在乳腺癌组织中表达降低甚至缺失[3]，在肿瘤侵袭转移中发挥重要的作用[4]。作者回顾性分析在汕头大学医学院附属肿瘤医院接受手术治疗的35例三阴性乳腺癌病理组织中E-cad的表达及其与临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2002年1月—2008年10月在汕头大学医学院附属肿瘤医院接受手术，并且具有完整临床资料和随访资料的乳腺癌患者35例，均病理确诊，且免疫组织化学实验显示雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2表达为阴性的三阴性乳腺癌。所有患者均为女性，术前均未进行任何辅助治疗(放疗、化疗和内分泌治疗)，平均年龄49.1 (29～75)岁。

1.2 免疫组织化学方法

1.2.1 主要试剂及方法 术后样本在常规10%中性甲醛溶液中固定，经脱水、浸蜡、石蜡包埋后用于免疫组织化学检测。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，柠檬酸微波高压抗原修复，3%过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶，滴加正常羊血清以封闭非特异性的背景染色。滴加适当稀释一抗(1∶200)，兔抗人E-cad多克隆抗体(上海基因科技有限公司)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗后滴加适量GTVision即用型二抗(上海基因科技有限公司)。二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB，厦门迈新生物技术有限公司)染色，苏木素复染。用已知阳性组织切片作为阳性对照，阴性对照用PBS代替一抗，阳性表达为棕黄色颗粒，定位于细胞膜。

1.2.2 评分标准 由2位病理学医生对染色结果进行评估。以半定量法判定结果，镜下随机观察5个高倍镜视野，每个视野分别计算200个细胞，共计数1 000个细胞。按着色程度评分，未着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞所占比例评分，阳性细胞数＜6%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分:2项评分结果相乘，0～4分为低表达，5～12分为高表达。根据2002年美国癌症联合委员会第6版分期标准，确定临床肿瘤分期。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件，E-cad的表达与临床病理特征的关系分析用卡方检验，采用Kaplan-Meier方法Log-rank检验比较不同E-cad表达水平生存曲线的差异；应用Cox比例风险回归模型分析比较相对危险度，分析各因素对生存率的影响；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

35例中，年龄≤50岁19例，年龄＞50岁16例。临床病理资料见表1。全组患者的随访时间为6～139个月，中位随访时间为57个月。

2.1 E-cad的表达及其与临床病理特征的关系 E-cad主要表达于细胞膜，呈黄色或棕黄色(图1)。35例三阴性乳腺癌组织中E-cad高表达17例(48.6%)，低表达18例(51.4%)。E-cad的表达与患者的年龄(P＝0.877)、肿瘤大小(P＝0.600)、远处转移(P＝0.967)均无关；与淋巴结转移(P＝0.044)、临床肿瘤分期(P＝0.009)显著相关。淋巴结转移N0～N1与N2～N3比较(60.9%比25.0%)或临床肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ期比较(70.6%比25.0%)，患者E-cad的高表达率差异有统计学意义(P＜0.05)。在2例临床肿瘤分期为Ⅳ期的患者中，E-cad高表达和低表达各1例。见表1。

图1 E-cad在三阴性乳腺癌组织中的表达(免疫组织化学染色×400)

表1 35例E-cad表达与临床病理特征的关系

2.2 E-cad的表达与患者预后的关系 35例中，E-cad低表达18例，平均生存期71.5个月[95%置信区间(confidence interval，CI)40.07～101.00]；E-cad高表达 17例，平均生存期 103.0个月(95%CI 287.28～118.85)。E-cad低表达和高表达总体生存曲线差异有统计学意义(Log-rank检验，P＝0.014，图2)。

图2 E-cad低表达和高表达的三阴性乳腺癌患者总体生存曲线

Cox比例风险回归模型单因素分析显示淋巴结转移[风险比(hazard ratio，HR)7.378，95%CI 1.614～33.721，P＝0.010]、E-cad表达(HR 0.241，95%CI 0.072～0.814，P＝0.022)均为三阴性乳腺癌患者生存的预后因子；多因素分析显示E-cad高表达是三阴性乳腺癌患者独立的保护预后因子(HR 0.241，95%CI 0.072～0.814，P＝0.022)。见表2。

表2 三阴性乳腺癌患者生存影响因素的Cox比例风险回归模型分析

3 讨论

肿瘤的发生、发展、浸润、转移是一个多阶段、多因素的复杂过程，而浸润、转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。E-cad是钙黏素家族的一员，广泛分布于上皮组织中，是一种细胞跨膜糖蛋白，是调节细胞黏附反应的重要媒介。其在癌细胞中的表达不稳定，在多种上皮性肿瘤细胞如胃癌、直肠癌、甲状腺癌和卵巢癌等中表达下调，从而降低细胞间的连接，进而诱发肿瘤细胞的浸润、转移。研究表明，不同癌细胞株的浸润能力与E-cad表达水平呈负相关[5]，通过小干扰RNA技术干扰E-cad可使细胞获得侵袭能力[6-7]，而过表达E-cad则可有效抑制肿瘤细胞的浸润能力[8]。

E-cad表达降低是促进乳腺癌细胞转移的关键机制之一[9]，人群研究显示E-cad表达降低与乳腺癌病死率升高有关[10-11]。与非三阴性乳腺癌相比，三阴性乳腺癌是一种恶性程度高、侵袭性强及预后差为主要特征的乳腺癌临床病理类型，是目前乳腺癌治疗的难点之一。Tang等[12]研究显示，在三阴性乳腺癌中，E-cad的表达与肿瘤大小、临床肿瘤分期无关，但与淋巴结转移有关，在淋巴结转移的患者中缺失率更高(P＝0.016)，并且指出E-cad可以作为三阴性乳腺癌预后指标。本研究中，E-cad在三阴性乳腺癌中低表达率为51.4%，与淋巴结转移有关(P＝0.044)，与Tang的研究一致。此外，E-cad表达还与临床肿瘤分期有关，随着临床肿瘤分期的进展而降低(P＝0.009)。多因素生存分析显示，E-cad是影响三阴性乳腺癌患者生存的独立影响因素(P＝0.022)。

既往研究发现在鼻咽癌中，E-cad启动子区域高甲基化状态是导致E-cad表达水平下调的机制之一，应用去甲基化药物可恢复E-cad表达并抑制肿瘤细胞的恶性生物学特征[13]，E-cad启动子高甲基化是促成肿瘤细胞发生上皮间质转化的重要因素之一[14]。有研究指出，E-cad甲基化在乳腺癌中达50%以上，与E-cad低表达显著相关[15]。

由于E-cad在三阴性乳腺癌的侵袭转移中具有重要作用，重新恢复E-cad的表达能够抑制其侵袭转移。基因启动子区域的异常甲基化是E-cad表达下调的主要原因之一，反转基因的甲基化状态可用于肿瘤的治疗。目前DNA甲基转移酶抑制剂已经正式用于临床肿瘤的治疗[16]。未来应进一步分析E-cad甲基化和E-cad表达在三阴性乳腺癌中关系，并研究DNA甲基转移酶抑制剂在乳腺癌治疗方面的作用。

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Expression of E-cadherin and its prognostic significance in triple negative breast carcinoma

HONG Chaoqun1，ZHUANG Yixuan1，CHEN Jiming2，WU Xiao1，ZHANG Fan1
(1.Guangdong Province Key Laboratory for Breast Cancer Diagnosis and Treatment，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China；2.Traditional Chinese Medicine，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China)

Objective To study the protein expression of E-cadherin(E-cad)to understand its relationship with clinicopathological parameters and its influence on the prognosis of human triple negative breast carcinoma(TNBC).Methods We collected tumor tissues from 35 female patients with TNBC treated at the Cancer Hospital of Shantou University Medical College from January 2002 to October 2008.Immunohistochemistry was performed to detect the protein expression of E-cad in breast tumors，and the chi-square test was used to study the relationship between the E-cad expression and clinicopathological parameters.The Kaplan-Meier method and Cox regression model were conducted to study the influence of E-cad on the prognosis of TNBC.Results E-cad protein was expressed primarily in the cytomembrane.The low expression rate of E-cad in 35 TNBC tumors was 51.4%(18/35).The chi-square test revealed that the E-cad expression was related to TNM stage (P＝0.009)and lymph node metastasis(P＝0.044).The survival curves between the low protein isoaspartyl methyltransferase expression group and the high protein isoaspartyl methyltransferase expression group were significantly different(Log-rank P＝0.014).Cox regression model demonstrated that E-cad(hazard ratio 0.241，95%confidence interval 0.072—0.814，P＝0.022)was the independent prognostic factors for TNBC.Conclusion E-cad plays an important role in the progression of breast cancer and could be a novel prognostic factor for TNBC.

E-cadherin(E-cad)；Immunohistochemistry；Triple negative breast carcinoma

R737.9

B

2095-3097(2015)02-0074-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.02.003

2015-01-26 本文编辑:徐海琴)

广东省自然科学基金面上项目(S2013010015969)；广东省医学科研基金(B2012261)；汕头市医疗重点科技计划项目(汕府科[2012]113)；汕头大学医学院附属肿瘤医院青年基金(201410)

515041广东汕头，汕头大学医学院附属肿瘤医院广东省乳腺癌诊治研究重点实验室(洪超群，庄轶轩，吴 晓，张 凡)，中药房(陈继明)

张 凡，E-mail:lemon_fan＠163.com