FMCA技术分析大前庭水管综合征家系及产前诊断

高慧刘晶晶沈姗姗梁少明危林耿王沙燕

1暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院（深圳518020）

2亚能生物技术（深圳）有限公司（深圳518133）

【摘要】目的应用FMCA技术检测双侧前庭水管扩大家系SLC26A4基因，探讨前庭水管扩大与SLC26A4基因的关系及FMCA技术最优条件。方法收集EVA家系临床资料，基于荧光定量PCR熔解曲线平台，运用FMCA技术分析107例正常人，6个EVA家系19位成员的SLC26A4基因IVS7-2A>G（919-2A>G），2168A>G及1229C>T突变位点。并用直接测序技术予以验证。结果107例正常人中有2例SLC26A4基因杂合突变，突变率为1.87%；EVA家系中有3例SLC26A4基因纯合突变，3例SLC26A4基因复合杂合突变，10例SLC26A4基因杂合突变，3例无SLC26A4基因突变，SLC26A4基因突变率为84.21%。对家系a进行产前诊断，结果为IVS7-2A>G/1229C>T复合杂合突变。所有检测结果与测序结果一致，符合率为100%。结论 FMCA平台能快速检测SLC26A4基因的IVS7-2A>G，2168A>G与1229C>T突变，其操作简单，成本低。且经测序技术验证，结果准确。可作为诊断遗传性疾病及产前诊断的快速有效方法。

【关键词】耳聋；前庭水管扩大；SLC26A4基因；FMCA；探针熔解曲线分析技术

【中图分类号】R714.5　【文献标识码】A　【文章编号】1672-2922（2015）03-536-05

FMCA技术分析大前庭水管综合征家系及产前诊断

高慧1刘晶晶2沈姗姗1梁少明2危林耿2王沙燕1

1暨南大学第二临床医学院，深圳市人民医院（深圳518020）

2亚能生物技术（深圳）有限公司（深圳518133）

【摘要】目的应用FMCA技术检测双侧前庭水管扩大家系SLC26A4基因，探讨前庭水管扩大与SLC26A4基因的关系及FMCA技术最优条件。方法收集EVA家系临床资料，基于荧光定量PCR熔解曲线平台，运用FMCA技术分析107例正常人，6个EVA家系19位成员的SLC26A4基因IVS7-2A>G（919-2A>G），2168A>G及1229C>T突变位点。并用直接测序技术予以验证。结果107例正常人中有2例SLC26A4基因杂合突变，突变率为1.87%；EVA家系中有3例SLC26A4基因纯合突变，3例SLC26A4基因复合杂合突变，10例SLC26A4基因杂合突变，3例无SLC26A4基因突变，SLC26A4基因突变率为84.21%。对家系a进行产前诊断，结果为IVS7-2A>G/1229C>T复合杂合突变。所有检测结果与测序结果一致，符合率为100%。结论 FMCA平台能快速检测SLC26A4基因的IVS7-2A>G，2168A>G与1229C>T突变，其操作简单，成本低。且经测序技术验证，结果准确。可作为诊断遗传性疾病及产前诊断的快速有效方法。

【关键词】耳聋；前庭水管扩大；SLC26A4基因；FMCA；探针熔解曲线分析技术

【中图分类号】R714.5【文献标识码】A【文章编号】1672-2922（2015）03-536-05

耳聋是人类生活中常见的疾病，2006年第二次残疾人抽样调查数据显示，我国听力残疾达2004万，占残疾人总人数的24.16%[1]，前庭水管扩大（En⁃large Vestibular Aqueduct,EVA）是一种常见的与感音神经性耳聋相关的内耳畸形[2]，1996年Griffith[3]首次描述前庭水管扩大的家族遗传性，随后其被证实与SLC26A4、FOXI1及KCNJ10基因有关[4-6]。SLC26A4基因是我国第二常见的致聋基因，其突变可致EVA伴非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋（DFNB4）及Pendred综合症（PDS）[2]。研究发现SLC26A4基因具有种族特异性，T416P及IVS8+1G>A突变在北欧最常见，2168A>G突变在日本及韩国最常见，我国最常见突变位点是 IVS7-2A>G（919-2A>G），其次为2168A>G、1975G>C、1174A>T、IVS15+5G>A及1229C>T[2,7]。

目前，我国耳聋的临床诊断主要平台有基因芯片技术，飞行质谱仪及测序技术等方法[8]，但这些方法操作复杂，成本较高并且需要特殊的仪器。多色荧光熔解曲线分析技术（Multiplex FluorescenceMelt⁃ing Curve Analysis，FMCA）是基于荧光PCR熔解曲线平台，利用野生型和突变型模板DNA与探针匹配的碱基数不同，获得不同的Tm值，从而进行已知突变检测、基因分型及未知突变筛查[9]。该技术汲取了染料熔解曲线Tm值分型技术及荧光PCR多色多通道的双重优点，对基因每个突变位置只需设计一条探针，利用不同波长的荧光标记，即可实现多色多通道多位点的定性检测[9]。目前国内外已有少量文献报道利用熔解曲线技术分析致聋基因[10,11]，但国内尚未见到利用TaqMan探针结合熔解曲线技术检测SLC26A4基因的报道，本文利用TaqMan探针结合熔解曲线建立快速可靠的FMCA诊断技术，分析107例正常人，19例EVA家系成员的SLC26A4基因IVS7-2A>G、2168A>G及1229C>T突变位点，探讨前庭水管扩大与SLC26A4基因的关系及FMCA技术的最优检测条件。

1　资料与方法

1.1研究对象

遵循知情同意的原则，收集来自深圳市人民医院就诊的107例听力正常及内耳结构无异常的人群以及6个EVA小家系的19位成员。其中，家系a先证者母亲腹中孕有一胎儿，共两代4人；其余家系均为两代3人（图1）。

1.2样本采集与DNA提取

采用EDTA-K2抗凝管采集所有受试者的外周血2-3m l，胎儿基因检测选择在产妇孕中期（17周-23周）抽取羊水5-10ml。DNA提取采用德国QIAGEN公司的QIAamp DNA抽提试剂盒，按照提取步骤说明书提取DNA。取1.5ulDNA用Nanodrop 2000进行DNA纯度及浓度检测。

1.3制备标准品及绘制标准曲线

IVS7-2A>G位于SLC26A4基因exon7与exon8之间的内含子上，2168A>G位于exon19，1229C>T突变位于exon10，选择优化好的引物及PCR反应程序对SLC26A4基因exon7+8，10和19进行扩增，获得PCR产物送至上海旭冠生物科技发展有限公司进行克隆及构建突变位点，然后将构建好的质粒进行测序验证其准确性。利用构建的IVS7-2A>G，2168A>G及1229C>T突变型质粒与野生型质粒进行FMCA检测，并绘制标准曲线。

1.4方法

1.4.1引物及探针设计

应用Primer5.0及Oligo7.0设计相应位点的引物及TaqMan探针（表1），并将探针及引物在NC⁃BI-BLAST上进行序列同源性比对，送至上海英潍捷基贸易有限公司合成。

表1　引物及探针序列

1.4.2不对称PCR反应体系及反应条件优化

25ul反应体系：1×buffer，3.0mM MgCl2，200uM dNTPs，2.5U Taq酶，2.5U Taq Antibody，各上游引物0.4uM，各下游引物0.04uM(1229C>T上下游引物用量相反)，各TaqMan探针0.4 uM，20 ng DNA（50000copies质粒），加蒸馏水补至25ul。反应条件：第一步PCR扩增：95℃预变性5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，40个循环；第二步熔解曲线：95℃1min，40℃1min，以0.01℃/S的升温速率从40℃升至85℃并每升高1℃收集10次荧光。仪器选择：RocheLightCycler480-Ⅱ。

1.5测序验证

按照文献所述方法[12]将所有受试者DNA进行PCR扩增获得SLC26A4基因exon7+8，exon10和ex⁃on19，采用QIA quick PCR试剂盒将所得PCR产物进行纯化，利用ABI3130 DNA全自动测序仪进行正反向测序，最后将测序结果用DNAstar软件进行分析。

1.6统计学分析

利用SPSS13.0软件，选择卡方检验进行统计学分析，比较对照组与试验组之间差异有无统计学意义。

2　结果

2.1FMCA结果

2.1.1标准曲线的绘制

利用FMCA技术分析已构建好的野生型及突变型质粒样品，获得不同的Tm的熔解曲线（图2），结果显示：IVS7-2A>G野生型Tm为（61.5±0.5）℃，突变型Tm为（67.0±0.5）℃；2168A>G野生型Tm为（61± 0.5）℃，突变型Tm为（67.0±0.5）℃；1229C>T野生型Tm为（74.0±0.5）℃，突变型（68.0±0.5）℃。

2.1.2FMCA结果分析

对107例正常患者进行FMCA分析，结果显示2例存在IVS7-2杂合突变，其余均未发现突变，突变率为1.87%。6个EVA家系分析显示，来自5个家系的16位成员携带SLC26A4基因突变，其中3例为IVS7-2A>G纯合突变，8例IVS7-2A>G杂合突变，1例2168A>G杂合突变，1例IVS7-2A>G/2168A>G双重杂合突变，1例1229C>T杂合突变，2例IVS7-2A>G/ 1229C>T双重杂合突变，其遗传方式均符合常染色体隐性遗传。1个家系未检出SLC26A4基因突变。（表2）

2.2PCR产物测序结果

对所有受试者的SLC26A4基因exon7+8，10和19测序结果与FMCA技术检测结果完全一致，符合率为100%。(表3)

2.3统计学分析

卡方检验结果显示P=0.000（<0.05）,认为对照组与实验组之间差异有统计学意义。

3　讨论

SLC26A4基因与前庭水管扩大伴非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋密切相关，并且各国及种族之间有较大的差异，高加索人约有40%前庭水管扩大相关内耳畸形（EVA和Mondini畸形）患者携带有SLC26A4基因突变，日本约有78%，韩国约有92%；而我国则有97.9%，其中IVS7-2A>G最常见（57.63%），只有2.1%患者无SLC26A4突变[7]。2014年解放军总医院学者研究2686例就诊患者，结果显示SLC26A4基因致病突变全部在前庭水管扩大相关内耳畸形病人中检出[14]；并且双侧前庭水管扩大或单侧前庭水管扩大与SLC24A6基因的关系有明显的不同，双侧前庭水管扩大SLC26A4基因突变检出率为95.97%，而单侧仅为29.41%[15]。本文研究中正常样本人群共107人，有2例SLC26A4单等位基因突变，并且为最常见的IVS7-2A>G突变，突变率为1.87%，与其他文献所报道的人群突变率基本一致[16]。6个EVA家系先证者听力学检测均为双耳重度或极重度感音神经性耳聋，其中5例基因检测为纯合突变或复合杂合突变，1例无突变检出；所有家系成员基因检测结果显示84.21%携带SLC26A4基因突变，其中IVS7-2A>G突变频率最高，由于阳性样本量较小所以突变率与其他文献相比会有少许偏倚，经统计学分析显示试验组与对照组的突变率差异有统计学意义，认为EVA家系携带SLC26A4基因突变率高于正常人群。其中家系a中IIa-2为孕中期胎儿，基因检测为IVS7-2A>G/ 1229C>T复合杂合突变（图2BC）；Ⅰa-1与Ⅰa-2均为杂合突变，临床表型正常，为复合杂合突变，临床表型为极重度感音神经性耳聋伴双侧前庭水管扩大，根据文献报道[12]及常染色体隐性遗传规律推断该胎儿极有可能是聋儿。本研究家系e在SLC26A4基因exon7+8，10和19上均无突变；由于耳聋可由多种因素导致，并且SLC26A4基因突变位点已报道上百种（http://deafnessvariationdatabase.org/），SLC26A4基因常见的突变位点不足以确定该家系致聋原因，所以家系e的致聋原因仍需要近一步研究。

表2　EVA家系分析

目前，新一代测序技术已成为单基因遗传病检测的热门方法，也是全球普及的高通量测序技术，可并行对几百万个DNA分子同时测序，快速筛选致病基因及未知突变[17]。2010年新一代测序技术已成功应用于耳聋相关新基因的筛选[18]；同年，Shearer等[19]成功地将新一代测序技术应用于耳聋基因的临床检测。近年来，耳聋相关新基因及新突变位点的发现数量呈直线上升与新一代测序技术的应用及发展密不可分[8]。但由于仪器昂贵、捕获目的区域的偏倚及数据分析等难题[17]，导致新一代测序技术从实验室到临床应用还有较长一段路程。而FMCA分析技术[9]基于荧光PCR，操作简单，结果可靠，更加便于在医院实施；目前已在临床上实现β-地中海贫血24个突变位点检测[20]，G6PD基因16个突变位点分析[21]及结合杆菌耐药性检测[22]等遗传病及病原体的诊断。本实验即是利用TaqMan探针及不对称PCR体系，建立快速可靠的FMCA技术检测SLC26A4基因，结果显示IVS7-2A>G野生型Tm与突变型Tm相差（ΔTm）约5.3℃；2168A>G的ΔTm约6.5℃；1229C>T的ΔTm约6℃。可见野生型与突变型Tm值相差约5℃以上，易于分型，结果简单易读，通过测序验证显示其符合率为100%。一般认为熔解曲线分析应选用不被水解的探针，如利用杂交探针结合熔解曲线分析载脂蛋白E基因型[23]；运用碱基淬灭探针结合熔解曲线技术分析线粒体DNA 12SrRNA的1555A>G与1494C>T突变[11]。本研究选用普通的TaqMan水解探针，较其他探针设计简单，合成方便及成本低，且在熔解曲线分析中不受Taq酶影响[9]，并可获得较高的熔解曲线峰值；但其要注意试验成功的关键条件：（1）探针的设计：选择较低特异性、能与野生链及突变链有效结合的探针，一般探针长度较长（表1）；探针突变碱基为C（C-G/A）的ΔTm大于T（T-G/A）（图3AB），更适用于杂合子分析。（2）不对称PCR：引物比为10：1体系优于1：1的体系（图3）。（3）实验显示Tm值存在批间差异，每次实验必须建立标准曲线。

表3　FMCA方法检测SLC26A4基因的评价

前庭水管扩大伴非综合征型常染色体隐性遗传性耳聋与SLC26A4基因密切相关，利用FMCA平台成功检测SLC26A4基因的IVS7-2A>G、2168A>G与1229C>T突变，其操作简单，成本低；且经测序技术验证，符合率为100%；可作为诊断遗传性疾病及产前诊断的快速有效方法。由于本实验纳入阳性样本量过少，并且检测位点局限，实现高通量多位点的FMCA技术仍需要进一步加深研究。

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App lication of FMCA in fam iliesw ith enlarge vestibular aqueductand in prenataldiagnosis

GAOHui1,LIU Jingjing2,SHEN Shanshan1,LIANGShaoming2,WEILingeng2,WANGShayan1
1 Second ClinicalMedicalCollegeof Jinan University,Shenzhen People'sHospital,Shenzhen 518020,China
2 Yaneng Bioscience(Shenzhen)Co.Ltd,518133,China
Corresponding author:WANGShayan,Email:shayanw@yahoo.com

Objective To report applications of the FMCA technology for testing the SLC26A4 gene in fam iliesw ith bilateral enlarged vestibular aqueduct(EⅤA)to analyze relations between EⅤA and SLC26A4 and to determ ine conditions for optimization of the FMCA technology.Methods Clinical data of EⅤA familieswere collected.ⅠⅤS7-2A>G,2168A>G, 1229C>Tmutations of the SLC26A4 gene in 107 normal controls and 19 subjects from 6 EⅤA familieswere analyzed by FMCA technology and resultswere confirmed w ith directDNA sequencing.Results Heterozygousmutations of SLC26A4 were detected in 2 subjects among the 107 normal controls(1.87%).Ⅰn the EⅤA fam ilies,homozygousmutations of the SLC26A4 genewas detected in 3 subjects,compound heterozygousmutations in 3 subjects and simple heterozygousmutations in 10 subjects(84.21%),and 3 subjects showed nomutations.The technology was used in prenatal diagnosis in one fam ily and showedⅠⅤS7-2A>G/1229C>T compound heterozygousmutationsof the SLC26A4 gene.A ll resultswere consistentw ith DNA sequencing.Conclusion Our study shows that FMCA can quickly detectⅠⅤS7-2A>G,2168A>G,1229C>T mutationsof the SLC26A4 gene.Backed by DNA sequencing,our results indicate that FMCA can be used asa fast,economic and effectivemethod in diagnosisof genetic diseasesand in prenataldiagnosis.

Hereditary hearing loss;EnlargeⅤestibular Aqueduct;SLC26A4;FMCA;Melting Curve Analysis Based on Probes.

10.3969/j.issn.1672-2922.2015.03.036

2013年深圳市战略新兴产业发展专项资金（CXZZ20130517143111780）

高慧，硕士研究生，研究方向：医学遗传学

王沙燕，Email：shayanw@yahoo.com

2015-1-29 审核人：郭维维)