细胞工厂培养猪繁殖与呼吸综合征病毒工艺优化研究

张爽

（辽宁省锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121000）

细胞工厂培养猪繁殖与呼吸综合征病毒工艺优化研究

张爽

（辽宁省锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121000）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。PRRSV只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。本病尚无有效治疗药物，疫苗免疫接种是预防和控制PRRS的根本措施。

目前，PRRSV主要是转瓶细胞培养的传统培养方式。但转瓶培养细胞增殖较为缓慢而且生产过程中无法提供最佳的培养条件，造成该方法自动化程度低，劳动强度大，产量低等问题。进而我们进行了用细胞工厂培养PRRSV的试验研究。

1 材料

1.1 毒株

PRRSV（HuN4-F112株），购自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂

DMEM培养基购自Gibco公司，进口胎牛血清购自Hyclone，胰酶购自Washington公司，Nunc EasyFill细胞工厂（10层，培养面积6320cm2，工作容量2000mL）购自Thermo Fisher。

1.3 细胞及传代培养

细胞：Marc-145细胞购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，在本实验室已扩增冻存，目前在本实验室传至75代，已经适应在本实验室的培养基中生长。

2 方法

2.1 细胞传代的方法

首先复苏所选择的种细胞Marc-145到T75的细胞瓶中，生长48h左右，按照1:4的比例进行传代；然后把6个长满细胞的T75细胞瓶中的细胞传到1个10L转瓶进行培养；48h左右按照1:3的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为DMEM，血清为胎牛血清，使用量为10%。

收获转瓶中的细胞：将转瓶中所得细胞用PBS洗涤2次，然后加入浓度为0.25%胰酶-EDTA溶液125mL消化，收集细胞。

收获得细胞经计数后，采用Thermo Scientific Nunc细胞工厂（10层，培养面积6320cm2，工作容量2000mL)对Marc-145细胞进行培养；所用的培养基是DMEM培养基。所用其它试剂包括牛血清、TPCK-胰酶等。细胞接种后在12h、24h、48h取样观察细胞在细胞工厂上的生长状况。

2.2 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒在细胞工厂中增殖条件优化

分别研究了细胞密度、病毒感染复数（MOI）、维持液中血清浓度和病毒吸附时间4个因素对蓝耳病病毒（PRRSV）增殖的影响，比较PRRSV病毒在不同增殖条件下TCID50的差异。

2.2.1 细胞密度对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒增殖的影响在不同细胞密度（表1），按MOI=0.2接种病毒，37℃培养，CPE达80%左右收获病毒，比较PRRS病毒TCID50，结果见表1。

表1 不同细胞密度接毒病毒TCID50

从表1中可以看出，细胞密度为0.8×105细胞/mL时，PRRSV的病毒滴度达到了108.15；优于其它处理。因此，本发明利用细胞工厂增殖PRRS病毒的细胞密度确定为0.8× 105细胞/mL。

2.2.2 病毒感染复数（MOI）对PRRS病毒增殖的影响在细胞密度为0.8×105细胞/mL，按MOI=0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.5分别接种PRRS病毒，37℃培养，CPE达80%左右收获病毒。比较PRRS病毒TCID50，结果见表2。

表2 不同病毒感染复数对PRRSV增殖的影响

从表2中可以看出，病毒感染复数MOI为0.8时，PRRS病毒滴度达到了108.41；优于另外几种处理。病毒感染量过低使增值速度降低，无法达到较高的病毒滴度。因此，本发明利用细胞工厂增殖PRRS病毒的病毒感染复数MOI为0.8，病毒增值速度较快，且达到较高的TCID50。

2.2.3 血清浓度对PRRS病毒增殖的影响在细胞密度为0.8×105细胞/mL，按MOI=0.8接种PRRS病毒，血清浓度分别为1%、2%、3%、4%和5%，37℃培养，CPE达80%左右收获病毒，测定TCID50，结果见表3。

表3 不同血清浓度对病毒增殖的影响

从表3中可以看出，当维持液中血清浓度在1%～3%之间，病毒的病毒滴度变化不明显且滴度很高，所以维持的浓度保持在1%～3%之间即可。

2.2.4 病毒吸附时间对PRRS病毒增殖的影响在细胞密度为0.8×105细胞/mL，按MOI=0.8接种PRRS病毒，病毒维持液中血清浓度为2%，37℃培养，CPE达到80左右收获病毒，比较PRRS病毒滴度，结果见表4。

表4 不同病毒吸附时间对病毒增殖的影响

实验结果表明，在静止接毒过程中，PRRSV吸附时间不宜过长也不宜过短，这样都会早产病毒滴度降低。时间短，病毒还没有吸附到细胞中去，时间长，细胞由于长时间吸收不到营养，对细胞的生长造成影响，从而间接影响到病毒在细胞中的复制，从而影响了病毒滴度。

3 结果

3.1 PRRSV在细胞工厂中增殖条件的优化结果

综上，确定PRRS病毒在细胞工厂中增殖的最佳条件为：细胞密度0.8×105细胞/mL；按MOI=0.8接种PRRS病毒；病毒维持液中血清浓度为1%～3%；病毒吸附时间为1h，37℃培养。

3.2 病毒含量测定结果

利用TCID50方法进行病毒含量的测定。病毒TCID50测定时，以MEM培养液将培养得到的PRRSV液作连续10倍稀释，即10-1、10-2……10-8，每个稀释度取100μL加入96孔细胞培养板的孔中，随后加入经胰蛋白酶-EDTA消化分散的Marc-145细胞悬液，每孔100μL（细胞含量以3× 105/mL左右为宜），每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置5%CO2培养箱中，37℃培养，逐日观察细胞病变和对照，共观察2～5d，并记录细胞病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50。同时以相同的方法对用转瓶培养的PRRS病毒液进行TCID50测定。以此作为对照组。

表5 PRRSV含量培养时间（5d）

实验结果见表5，由结果表明，利用又细胞工厂培养的PRRSV液病毒含量高于转瓶培养的PRRSV液病毒含量。

4 讨论

实验结果表明，用细胞工厂培养的PRRSV显著优于传统转瓶培养的病毒含量。细胞工厂培养病毒方法，体现了连续培养和规模化生产动物细胞和病毒的趋势，与传统的转瓶培养工艺相比，抗原效价提高显著，而且产品质量均一；生产工艺简化，操作简单，提高生产效率，降低生产成本。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.020