鸡新城疫病原学及疫苗研究进展

文│崔健（山东省临朐县检验检测中心）

鸡新城疫病原学及疫苗研究进展

文│崔健（山东省临朐县检验检测中心）

鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）又称为亚洲鸡瘟、伪鸡瘟，我国俗称鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一种主要侵害鸡和火鸡的急性、高度接触性和高度毁灭性的禽类烈性传染病。强毒感染易感禽在临床上常呈败血性经过，主要特征是呼吸困难、下痢、神经机能紊乱、黏膜和浆膜出血。本病发病急、致死率高，经常给养禽业造成巨大的经济损失，世界动物卫生组织将其列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

ND于1926年首次发现于印度尼西亚的爪哇岛，同年发现于英国纽卡斯尔市（Newcastle），1927年Doyle首次分离到病原，根据发现地名命名为新城疫，经过30多年时间传播到世界各地。我国于1928年有类似本病的记录，1935年发生地方性流行。1946年，梁英和马闻天第一次报道在1935年发病的病料中分离到新城疫病毒，从而确认本病在我国的存在。

ND传播迅速，死亡率高，是严重危害养禽业的重要疫病之一。最近几年除鸡发生本病外，过去很少出现临床症状的鸭、鹅等水禽和其他经济禽类以及鸟类发生新城疫的报道也逐年增加，并引起了国内外专家学者的重视和不断深入研究。本文着重对新城疫的病原学、毒力演化以及疫苗研究近况等方面进行综述。

一、病原学

1.NDV的一般生物学特性。

NDV为副粘病毒科腮腺炎病毒属。NDV完整病毒粒子近圆形，直径为10～250纳米。但常因囊膜破损而形态不规则，也常见横断直径为100纳米左右的不同长度的细丝。有囊膜，在囊膜的外层有呈放射状排列的纤突，能刺激宿主产生抑制病毒凝集红细胞的抗体和病毒中和抗体。

病毒核酸类型为单股负链不分节段的RNA，基因组是由15186或15192个核苷酸构成，在NDV基因组上依次排列着NP、P、M、F、HN和L基因，分别编码核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶（HN）和大分子蛋白（L）。

尽管病毒在宿主体外生存受环境温度、湿度、阳光和病毒数量、毒株种类、贮存条件及是否存在有机物等多种因素的影响，总体而言NDV对理化因素的抵抗力比较强。NDV在pH3～10时不被破坏，真空冻干病毒30℃可存活30天，在4℃几周、-20℃几个月、-70℃几年后仍能保持感染力。但NDV对消毒剂、高温及紫外线较敏感，在直射阳光下经30分钟即可死亡。一般消毒剂常用浓度杀毒效果良好，如5%漂白粉、1%氢氧化钠、70%酒精20分钟即可将NDV杀死。

2.NDV的生物学活性。

（1）血凝活性（HA）。NDV的血凝活性是由于其囊膜表面的HN糖蛋白与红细胞的表面受体结合所引起的。NDV可凝集所有两栖类、爬行类、禽类及小鼠、豚鼠的红细胞，但凝集牛、绵羊、山羊、猪、马及人O型血红细胞的能力则随毒株的不同而有变化。利用这一特性，用鸡的红细胞做HA试验，并结合抗血清的特异性抑制作用（即HI试验）可诊断ND的发生和监测免疫状况。

（2）神经氨酸酶活性（NA）。神经氨酸酶（黏多糖N-乙酰神经氨酸水解酶）是HN蛋白的一部分，该酶的作用是可将病毒逐渐从红细胞上洗脱下来，还可作用于受体位点，使F蛋白充分接近细胞而发生病毒与细胞的膜融合。

（3）细胞融合与溶血活性。NDV可引起红细胞溶解或与其他细胞融合。病毒复制时附着于受体位点，随后引起病毒囊膜与细胞膜的融合，进而导致两个或多个细胞的融合，该活性也可被特异性抗血清抑制。

（4）其他活性。最近的研究发现，NDV除了有诱导干扰素生成的作用，还有抗肿瘤免疫、引起细胞凋亡的作用。研究显示，NDV能选择性地杀伤肿瘤细胞，而对人的成纤维细胞没有杀伤作用。许多人类的肿瘤细胞都能高效地被NDV感染，并通过肿瘤细胞增殖进行自我复制，这种增殖与复制无传染性。Schinmmacher等发现NDV有促进巨噬细胞抗肿瘤活动的能力，诱导出现抗肿瘤白细胞聚集和抗肿瘤细胞毒作用以及诱导肿瘤坏死因子（TNF）的表达，还可抑制肿瘤细胞的转移和生长。

3.NDV的结构蛋白及其功能。

研究表明，HN、F两种糖蛋白是构成NDV致病性的分子基础。F蛋白分子量为59千道尔顿，由553个氨基酸组成，以羧基端嵌合在病毒囊膜上，具有使病毒囊膜与宿主细胞膜融合、导致病毒进入细胞和溶血的作用。

HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒侵染过程中的作用是识别细胞受体、介导病毒吸附于靶细胞膜上的唾液酸受体而启动感染过程以及在病毒复制周期中加强病毒颗粒的移动和促进从感染细胞中释放。

4.NDV的基因型、致病型和抗原型。NDV只有一个血清型，使用传统的试验手段对NDV不同毒株的差异性分析只能采用毒力、蚀斑形成能力测定或单克隆抗体技术等试验来进行，但如此分型存在一些局限性，使得NDV流行病学研究一直难以突破。

随着分子生物学技术的不断发展，Ballagi等最早在分子水平上对不同的NDV毒株进行差异性分析，从而进行基因分型的方法。

方法一是应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术扩增NDVF基因全长75%的片段（即334-1682nt位核苷酸片段），通过对扩增片段的核酸序列分析和3种限制性内切酶（HinfI、Bst0I、Rsal）的酶切位点的分布情况分析，将NDV毒株进行基因分型。

方法二是应用RT-PCR技术扩增NDVF基因高变区，即47-420nt（ORF的1-374nt）位基因片段，对该片段进行核酸序列测定，然后绘制遗传进化树，确定NDV的分型。遗传进化树分析和酶切图谱分析反映的NDV毒株之间的遗传关系相当一致。

依据这种方法，目前可以将NDV分为10个基因型，NDV也显现出一定的遗传演化规律，新城疫的每一次大流行都会有新的基因型出现，并且以新基因型为主。

二、NDV的演化与遗传进化

1.世界ND的流行。综合近十年来的研究发现，NDV并没有出现超强毒株，但是在强大的疫苗免疫压力和用药环境之下，NDV毒株呈现出毒力逐渐增强而引发疾病的现象，尤其是近年来导致水禽发病。综合国内外有关NDV毒力的变化和新城疫在全球的发生，共有过3次大流行。

第一次是于1926年起源于东南亚，经亚洲向欧洲的缓慢传播，经30年传播到世界各地。研究证实，20世纪30至50年代世界上ND的大流行主要由基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型NDV引起。第二次大流行于20世纪60年代末，起始于中东，至1973年就已波及大多数国家。这次大流行之所以传播如此迅速，是由于家禽饲养方式的变革及大规模国际贸易造成的。此次大流行主要由基因Ⅳ和Ⅴ型所致。第三次大流行的暴发于70年代末起源于中东，发病鸡主要为神经型，无呼吸道症状，1981年到达欧洲后迅速蔓延到世界各地，主要由基因Ⅴ、Ⅵ型引起。

20世纪90年代以来，虽然没有出现世界性的大流行，但局部地区的流行和爆发时常发生，此时期的NDV主要以基因Ⅶ型为主。而且此时新城疫的发生均出现在免疫鸡群中，死亡率不是很高，但由于造成生产性能的降低，所造成的损失仍然十分严重。

2.我国ND的流行特点。进入20世纪80年代中后期，我国ND的流行呈现出了一些新的特点：

（1）非典型ND已经成为ND流行的主要形式。往往发生于免疫鸡群；发病时间主要集中在免疫前后，同时也有相当数量的鸡群发病日龄提前，甚至10日龄以前就有鸡只发病；流行的方式以地方性散发或小规模流行为主，多发于冬春两季；病鸡的临床表现和病理变化差异很大，多不具有典型的消化道症状。病程较长，发病率高低不等，死亡率不高，但对鸡群的生产性能影响较大。

（2）鸭、鹅等水禽中出现了致病性强的NDV。以往认为水禽和其他禽类抵抗力甚强，即使强毒株感染水禽也不表现症状。然而，近年在我国水禽饲养密集地区，由NDV引起鸭的发病及鹅的死亡越来越普遍。这可能表明，出现了对水禽特别是鹅呈高致病力的致病型。研究表明它属于基因Ⅶ型，对鸡亦是高致病性的，而且在抗原性上显示出与经典的NDV存在明显差异。

近十年来，我国学者对国内NDV的分子流行病学进行了大量调查研究，综合这些文献发现，20世纪90年代以来我国新城疫的流行情况与世界的流行趋势相符，但同时又有自身的特点，虽然主要以基因Ⅶ型为主，但其他老基因型也一直存在。基因Ⅶd型和基因Ⅶe型是我国近年来的优势流行株，而基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ型在我国不同的地区仍然存在，这些老基因型的存在增加了我国对NDV研究的复杂性。

在流行毒株方面同样也是有着明显规律，除了第三次大流行中的基因Ⅵ型以外，基因Ⅶ型是遍及全世界的流行毒株，是分布和出现几率最高的基因型。而在中国除了这两种基因型以外，还有一种与基因Ⅲ型关系较近的、我国特有的基因Ⅸ型的流行。

三、ND疫苗

目前，ND疫苗的种类较多，不同种类的疫苗免疫性能、免疫方法不同，主要有活苗、灭活苗和基因工程疫苗。

1.活苗。目前我国常用的活疫苗有两大类：中等毒力的I系和弱毒的Ⅱ系、Ⅲ系和Ⅳ系。

中等毒力Ⅰ系疫苗，如Mukteswar株（Ⅰ系）、Roakin株、Komorov株和Hertfordshire株（Herts33）等，免疫原性强，中等毒力，只适用于1月龄以上的鸡，对幼雏有一定的致病性，产生的免疫力持久。

Ⅱ系苗，可用于首免和加强免疫，接种方法可喷雾、点眼、滴鼻、饮水和注射，目前多用于种鸡首免。

Ⅲ系（也称F系）苗，毒力介于Ⅱ系和Ⅳ系之间，可用于7日龄以上鸡的免疫，目前应用较少。

Ⅳ系苗的毒力和免疫原性都比Ⅱ系稍强，代表株为LaSota株，适用于任何日龄的鸡，也是目前应用最多的弱毒疫苗毒株。一般用于7日龄以上鸡的首免和加强免疫。

另外，随着细胞培养技术和单克隆技术的发展，细胞苗和克隆苗也越来越多地被应用。如Clone-30弱毒苗、单克隆N-79型LaSota弱毒株、克隆-83等，其特点是毒力低、免疫源性好，可用于具有较高母源抗体的雏鸡。

活疫苗成本低廉，操作方便，能快速产生局部免疫，便于大群免疫，能同时刺激产生体液免疫和细胞免疫，免疫效果好，因此在世界许多国家被广泛用来防治新城疫。

但是弱毒疫苗和中等毒力疫苗可在鸡呼吸道复制，引起温和的病变，其也存在毒力可能返强、散毒风险，中等毒力毒株也可能对免疫鸡引起接种反应，安全性受到质疑。

2.灭活疫苗。灭活疫苗不存在安全性问题，可引起坚强而持久的免疫力。常用的灭活疫苗是油佐剂灭活苗，最常用于蛋鸡和种鸡，但是因为其产生免疫力的时间较长，雏鸡使用时应配合弱毒活疫苗同时使用。

灭活疫苗是用物理或化学方法灭活病毒获得疫苗抗原，并用佐剂乳化成的疫苗。因使用已灭活的抗原，所以安全性好。目前新城疫白油佐剂灭活疫苗应用较为广泛，直到目前仍然被当作重要的免疫预防疫苗。无论灭活疫苗还是活疫苗免疫预防新城疫，必须制定合理的免疫程序，才能发挥疫苗最大效力保证抵抗病毒攻击。

3.基因工程疫苗。随着分子生物学理论和技术上的发展，体外重组DNA技术使得NDV基因工程疫苗的研制成为研究热点。从80年代末至今，已有多种NDV毒株的糖蛋白F和（或）HN基因在多种病毒载体上得到表达，制备出重组活载体疫苗或亚单位疫苗。

杆状病毒载体系统是研制NDV亚单位苗的主要工具。迄今为止，已有NDV B1株、Hitchner株、Miyadera株、D26株的HN和F基因在杆状病毒系统中表达。用感染重组杆状病毒的家蚕或组织细胞加工制备成的油佐剂疫苗免疫试验鸡，能抵抗强毒的攻击。

在重组鸡痘病毒载体中，不论是单独表达F或HN糖蛋白之一，还是共同表达F和HN糖蛋白，都能使被其免疫的无特定病原体（SPF）鸡产生对NDV强毒攻击的保护作用，这种保护力至少维持8周。Taylor等发现，表达F的重组鸡痘病毒肌肉或皮下接种优于口服或滴鼻免疫，产生抗体的过程快而且水平高，能够产生完全保护。

美国农业部于1995年正式批准了第一个重组鸡痘病毒活载体疫苗-VectorVAXFP-N的商品化，该重组活疫苗免疫效果与常规ND疫苗相当，并且一次免疫即可保护鸡抵抗NDV强毒的攻击。同时，Wolff、Scanlon、Gorman、Hodder及我国学者陈洪岩等在基因疫苗、抗独特型抗体疫苗的研制方面都曾进行了有益探索，并取得了一定的进展。

由于传统疫苗在安全性、稳定性及免疫原性等方面存在一些不足，许多学者都致力于研制更为安全有效的疫苗。基因工程疫苗具有毒性低、免疫源性好、生产成本低、利于大批量生产、易于区分自然感染与免疫感染及便于诊断的优点，是今后ND疫苗发展的方向。