人类白细胞相关抗原G 与复发性流产患者滋养细胞侵袭功能

张若鹏，王光明，阿周存，朱任坚

（大理大学附属医院 1．生殖医学科；2．病理科；4．妇产科；3．大理大学医学遗传学教研室，云南 大理 671000）

复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指同一伴侣连续发生3 次及3 次以上的自然流产[1]。其发生率占妊娠的1%～2%，其中40%～60%经各种临床检查未发现明确病因称不明原因复发性流产。目前的主要治疗方案为免疫治疗，但是仍然有20%～40%失败率。众多的研究证明HLA-G 的表达水平与器官移植及妊娠的成功率呈明显正相关。绒毛外滋养层细胞（extravillouscytotrophoblasts,EVCT）HLA-G 表达下降、侵袭功能不足与RSA 的发生密切相关[2]，而内源性HLA-G 表达强的胚胎妊娠成功率明显高于表达相对较弱的胚胎。采用外源性HLA-G 干预能否补充RSA 患者胚胎自身HLA-G 抗原表达不足的缺陷，提高胚胎种植的活力及最终提高妊娠成功率。本研究采用 可 溶 性 HLA-G（solubleHuman Leukocyte Antigen-G，sHLA-G）体外干预对RSA 患者滋养细胞侵袭能力的影响进行了研究。

资料与方法 1．病例及分组：为我院2013年10 月-2014 年3 月于我院行人工流产患者。研究分为正常组及RSA 组。正常组40 例，随机选自正常早孕人流患者 孕8 周～10 周，无自然流产史；RSA 组40 例，本次妊娠因保胎失败而终止妊娠。于人流术中收集两组患者绒毛，收集过程中尽量保持无菌，立即置于培养液中快速送往实验室。RSA 组每例绒毛滋养细胞接种3 份，根据干预措施不同又分为 RSA 对照组及研究1 组（RSA＋0.05%终浓度sHLA-G 干预）、研究2 组（RSA＋0.1%终浓度sHLA-G 干预）。

2．试剂及仪器：人源性sHLA-G（浓度为1g/L）购于EXBIO 公司，抗人CD146 单克隆抗体购于AbD serotec 公司。流式细胞仪由美国贝克曼公司提供。

3．滋养细胞培养：将绒毛组织置于无菌培养皿中，用含100U/ml 青霉素、10%FCS 的DMEM高糖培养液快速、充分洗涤1 次，仔细剪去膜状物 将绒毛剪碎约1mm3大小，似糊状，加入0.25%胰酶15ml 消化混合均匀，置于37℃恒温箱中消化30min，消化完立即用等体积 15ml 10% FCS DMEM 中和，经200 目不锈钢滤网过滤。将滤液1 000r min（r=14cm）离心10min，所得细胞团在用10% FCS DMEM 洗涤一次后接种于含 10ml 10%FCS DMEM 培养液的培养瓶中，RSA 组患者滋养细胞每例接种3 瓶，置于体积分数5%CO2培养箱内培养。接种24h 更换培养液。正常组及RSA 对照组：于培养瓶中均加入生理盐水10μl，研究1 组、研究2 组于培养瓶中分别加入1g/L sHLA-G 5μl、10μl 进行干预，培养16h。

4．CD146 检测：取悬浮细胞液1 200r/min 离心10 min 得EVCT 单核细胞团，对不同干预组不同的单核细胞团加入8μl CD146 抗体避光10min，加入溶血素1ml 避光5min 去除红细胞干扰，用PBS 洗涤一次，最后加入1mL PBS 摇匀上流式检测CD146 阳性率。

5．统计分析：采用SPSS11.0 统计学软件进行分析。连续性正态分布的计量资料，采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间均数比较采用ANOVA 方差分析，组间比较采用LSD 检验。

结 果 1．正常妊娠及RSA 患者EVCT 表达CD146 表达正常妊娠组EVCT CD146 阳性率为（68.33±6.21）%，而RSA 对 照 组 为（9.98±3.20）%，两者比较差异有极显著性，P＜0.01。

2．不同浓度sHLA-G 干预后RSA 患者EVCT CD146 表 达 变 化0.5μg/ml 及1μg/ml 终 浓 度sHLA-G 干预EVCT 的CD146 的阳性率分别为（31.20±6.91）%，及（62.22±9.16）%，均显著高 于RSA 对 照 组，P均＜0.01；而0.5μg/ml 及1μg/mL两组之间比较，CD146 阳性率差异亦有显著意义，1μg/ml 干预组明显高于0.5μg/ml 组，P＜0.01。1μg/ml sHLA-G 干预组与正常组比较，差异无统计学意义P＞0.05。

讨 论 HLA-G 属于非经典HLA-I 类基因，位于6 号染色体短臂，其基因产物分为膜结合型及可溶性型（sHLA-G）。HLA-G 基因及蛋白呈低度多态性，个体间差别不大，主要表达在绒毛外滋养细胞[3]。CD146 是最近确定的Ig 基因超家族成员，是一种细胞黏附分子，在绒毛植入及胚胎形成过程中发挥重要作用。主要表达在绒毛外层滋养细胞，在胚胎种植部位侵犯和代替螺旋动脉，导致血流通过螺旋动脉不受阻碍地进入胎盘绒毛间隙，从而建立母体- 胎儿循环，是反映滋养细胞侵袭能力的重要指标之一。

已有的研究表明HLA-G 属于免疫抑制因子，通过多种途径产生免疫调节及保护作用，形成母胎界面特殊的免疫耐受，其机制包括：与自然杀伤（NK）细胞及杀伤性T（Tc）细胞表面受体结合，抑制NK 及Tc 细胞毒效应；还可通过介导NK及Tc 细胞凋亡而有效抑制NK 及Tc 细胞溶解靶细胞；调节Th1/Th2 平衡，抑制外周血及蜕膜CD4＋T 细胞分泌IL-2 IFN-r TNF-a 等Th1 型细胞因子，促进IL-4、IL-10 等Th2 型因子分泌。在妊娠头3个月，HLA-G 的表达下降，可使滋养细胞侵蚀分化过程受阻，滋养细胞不易侵入子宫蜕膜及重铸螺旋动脉，绒毛着床过浅，血管发育欠佳，不能有效供应胎盘营养，使胎盘生长发育受限，导致胎儿生长受限、自然流产。本研究显示，复发性流产组绒毛外滋养层细胞CD146 表达明显低于正常妊娠组，提示滋养细胞侵袭能力下降是RSA 发生的病理生理机制之一[4]。

外源性sHLA-G 干预对滋养细胞的影响。采用外源性sHLA-G 干预 可补充RSA 患者HLA-G表达不足，发挥HLA-G 对妊娠的保护作用，有利于滋养细胞及胚胎的正常发育。本研究显示补充外源性sHLA-G 后，RSA 患者的滋养细胞CD146表达明显升高，且其表达强度与培养液中HLA-G的浓度呈正相关。0.5μg/ml 干预组，CD146 的表达率较生理盐水组明显升高，当培养液中浓度达到1μg/ml 时则已接近正常妊娠HLA-G 诱导宿主免疫耐受不仅在母胎免疫平衡中得到证实而且在其他研究中亦得到充分证明。

［1］谢幸，苟文丽．妇产科学[M]．第8 版．北京：人民卫生出版社，2013，49.

［2］张铭艳，曾杰，胡吉英，等．HLA-G 蛋白在原因不明习惯性流产中的表达[J]．中国优生与遗传杂志，2011，19（1）：28-31．

［3］BERGER DS,HOGGE WA,BARMADA MM,et al.Comprehensive analysis of HLA-G implications for recurrent spontaneous abortion[J]．Reprod Sci,2010,17(4)：331-338．

［4］KOTZE DJ,HANSEN P,KESKINTEPE L,et al．Embryo selection criteria based on morphology versus the expression of a biochemical marker sHLA-G and agraduated embryo score prediction of pregnancy outcome[J]．J Assist Reprod Genet,2010,27(6)：309-316．