Taqman-LNA荧光PCR快速检测肉制品中马源性成分的研究

许如苏，周广彪，段建发，苏建晖，魏 霜，陈冠武

（汕头出入境检验检疫局，广东汕头 515031）

Taqman-LNA荧光PCR快速检测肉制品中马源性成分的研究

许如苏，周广彪，段建发，苏建晖，魏 霜，陈冠武

（汕头出入境检验检疫局，广东汕头 515031）

[目的] 建立快速检测肉制品中马源性成分的Taqman-LNA荧光PCR方法。[方法] 基于马的种属保守序列，设计特异性引物和Taqman-LNA探针，建立可快速检测肉制品中马源性成分的Taqman-LNA荧光PCR检测方法。通过对特异性、灵敏度、重复性的检测，对建立的方法进行评价。[结果] 建立的Taqman-LNA荧光PCR方法灵敏，可检测到马肉DNA最低限为1.4 pg；特异，与猪、牛、羊、鹿、驴、兔、鸡、鸭、鹅、虾无非特异性反应；可重复，批内和批间的变异系数均小于2%；准确，应用该法检测人为掺入马肉的肉制品，检测结果与预期相符。[结论 ]本研究建立的方法具有灵敏度高，特异性强，重复性好等优点，适合于肉制品中马源性成分检测。

马源性成分；锁核酸（LNA）探针；荧光定量PCR；肉制品

一些不法商家为牟取暴利，在标明某肉的肉制品中掺入低价位其它肉类，如在牛肉丸中掺入猪肉，在牛肉制品中掺入马肉等，极大地损坏了消费者的利益。在我国，媒体已多次曝光假冒牛羊肉卷事件。在瑞典、英国和法国等西方国家，也多次曝光用马肉假冒牛肉事件。BALLIN等对近千种肉制品的检测分析发现，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符现象[1]。目前，打击肉制品掺假已成为社

会关注的热点，而对肉制品中动物源性成分的快速鉴别是打假的重要技术手段。

对肉制品的掺假检测主要基于对动物源性成分的鉴别，尽管动物源性成分鉴别有多种方法，但以检测DNA为基础的分子生物学方法，尤其是PCR技术以稳定、准确、快速等优势而得到越来越广泛的应用[2-5]。然而，食品中DNA成分复杂，加之PCR技术的高灵敏度，使得应用PCR方法来鉴别物种存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，以PCR为基础，应用改良的引物探针设计策略已逐步成为肉类鉴别的新方向[6]。Taqman-LNA荧光探针是在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰成LNA碱基，通过提供探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定性、特异性和设计的灵活性[7]。目前，Taqman-LNA荧光PCR已在病原检测[8-11]、基因突变检测[12-13]等方面得到广泛应用，但该技术在动物源性成分检测方面国内尚未见相关报道。本研究利用Taqman-LNA荧光探针的上述优点，首次建立肉制品中马源性成分的Taqman-LNA荧光PCR检测方法，为该技术应用于其他动物源性成分的检测提供了借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

LightCycler®480型荧光定量PCR仪（Roche），高速离心机（Beckman），恒温干热器（Eppendorf）。

1.2 主要试剂

Probes Master 2×conc购自Roche公司；核酸提取（离心柱法）试剂盒购自达安公司。

1.3 肉及肉制品来源

从农贸市场和超市购买马、牛、羊、猪、鸡、鸭等动物肌肉和牛肉丸、羊肉串、羊肉丸、猪肉丸、肉肠、肉松等肉制品共80份样品，本单位提供进口牛肉样品10份。

1.4 样品制备和DNA提取

取样品10～25 g，剪碎后用绞肉机绞成糊状。称取30 mg，使用核酸提取（离心柱法）试剂盒进行DNA提取并测定DNA浓度。

1.5 引物探针设计与合成标记

使用Primer Express软件针对马的种属保守基因设计特异引物和锁核酸探针。正向引物序 列：5'-CCCACTATCAGGATTCATACCC-3'，反 向 引 物 序 列：5'-AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG-3'，LNA探 针 序 列： 5'-FAMCACCAAAAATAG+CAGCATCATCCTCC–BHQ1-3'，均由上海辉睿公司合成。

1.6 Taqman-LNA荧光PCR方法的建立

根据反应体系酶的特性、荧光PCR仪的特点和引物Tm值设定预反应条件，再通过对引物探针浓度和退火温度的优化，最后确定Taqman-LNA荧光PCR的最佳反应条件为：反应总体积为20μL，内含Probes Master 2×conc 10μL，10μmol/L上游和下游引物各0.4μL，10μmol/L锁核酸探针0.3μL，模板1μL；反应参数为：预变性95℃ 8min；95 ℃，10 s，58 ℃，30 s（收集荧光信号），40个循环。

1.6.1 特异性检验。以同一提取方法，同等肉量提取的马、猪、牛、羊、驴、鹿、驴、鸡、鸭、鹅、虾的DNA为模板，进行Taqman-LNA荧光PCR试验以检测方法的特异性。

1.6.2 灵敏度检验及标准曲线的建立。将从马肉提取的DNA 作10×系列稀释，分别进行Taqman-LNA荧光PCR试验。选取6个梯度的DNA浓度，以其对应的稀释倍数对数值与CP值制作标准曲线（由仪器配套软件自动生成）。

1.6.3 重复性检验。将从马肉提取的DNA 作10×系列稀释，取100～10-4稀释的DNA模板进行重复性试验，每次试验设3次重复，共进行3次试验，计算批内和批间CP值的变异系数V。V=标准差s/CP均值。

1.7 对人为掺入马肉肉制品的检测

选择已知成分的牛肉丸和羊肉串作为肉制品基质，分别按1.4制成糊状样品，按大约50%、30%、10%、5%和1%的比例在糊状样品中掺入绞碎马肉，混匀制成人为掺入马肉的肉制品，每个比例各取2份样品，按1.4提取DNA，采用本研究建立的方法进行检验，以评价方法的准确性。

1.8 对市售肉制品的检测

按1.4提取市售肉制品的DNA，采用本方法进行马源性成分检测。试验设马肉DNA和空白对照。

2 结果与分析

2.1 特异性

试验结果只有马肉出现典型扩增曲线，牛、羊、猪、驴、鹿、驴、鸡、鸭、鹅、虾肉均无扩增曲线（图1），说明本研究建立的方法具有高度特异性。

图1 特异性试验扩增曲线

2.2 灵敏度

使用10倍系列稀释的马肉提取的DNA为模板进行马源性成分检测，各梯度反应体系中的模板DNA量分别为140ng、14ng、1.4ng、0.14ng、0.014ng、0.0014ng、0.00014ng，相当于马肉含量为100%，10%，1%，0.1%，0.01%，0.001%和0.0001%。反应扩增曲线见图2。从图2可见，本方法可检测到马肉最低含量为0.0001%。当马肉含量在100% ～0.001%时，与CP值呈现良好的线性关系（图3）。y=-3.460lgx+15.18 扩增效率E=1.945，R2达到0.999以上。

图2 马肉DNA 10倍系列稀释的Taqman-LNA荧光PCR扩增曲线

图3 马肉DNA 10倍系列稀释的标准曲线

一方面，考虑到掺假的动机在于节约生产成本，掺假肉类的比例低于1%，则没有经济意义；另一方面，考虑到肉制品生产加工，销售运输过程可能被其他肉类污染，因此，将样品CP值-纯马肉CP值≤7判定为样品掺有马源性成分。

2.3 重复性

重复性检验结果，批内和批间CP值的变异系数分别小于1.5%和2%（表1），表明本法具有良好的可重复性和再现性。

表1 重复性试验结果

2.4 人为掺假样品检测结果

检测人为掺入马肉的牛肉丸和羊肉串共20份样品。结果与预期相符，检测结果100%正确（表2）。

2.5 对市售样品的检测结果

共检测市售样品牛肉及牛肉丸30份、羊肉和羊肉串10份、火腿肠等肉其他肉制品20份和进口牛肉10份，结果均未发现马源性成分。

3 结论与讨论

我国尚没有检测马源性成分的国家标准，只有地方标准DB 37/T 1020-2008 肉类制品中鸡肉、牛肉、猪肉和马肉成分PCR快速检测方法[14]。该标准采用普通PCR方法，存在费时、易污染、检测通量小等缺点。关于马源性成分的检测鉴定研究报道不多，李爱民等建立的羧化胶乳凝集抑制试验[15]虽成本低、操作简便，但不适合熟制马肉的检测。郑光明等建立了普通PCR鉴定马肉的方法[16]，该法使熟制马肉制品的鉴别成为可能，但该法存在普通PCR的缺点。李楠等建立了实时荧光PCR方法[17]，实现了肉制品中马源性成分的快速检测，但该法还有瑕疵，如与牛源性成分有一定交叉反应，存在假阳性误判可能。

表2 人为掺入马肉的肉制品检测结果

Taqman-LNA荧光探针是在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰成LNA碱基，而引入一个LNA碱基可以将探针的Tm值提高3℃～8℃，可以缩短探针长度，增加探针的稳定性、特异性和设计的灵活性，并可使探针信号增强、信噪比增大，从而显著减少实验检测的环境限制[7]。本研究利用Taqman-LNA荧光探针的上述优点，首次建立Taqman-LNA荧光PCR方法用于肉制品中的马源性成分检测，结果表明，该方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等优点，可在2小时内实现对肉制品中马源性成分的检测。

不同的DNA提取方法，或使用不同的DNA提取试剂盒，DNA提取率和纯度存在较大差异[18]。为避免因DNA提取对检测结果的影响，同时基于马肉含量在100% ～0.001%时，其含量与CP值呈现良好的线性关系（100% 马肉与1%马肉含量的CP值理论上相差约6.7），并考虑肉制品在生产加工及运输销售过程可能存在其他肉类污染，而掺假肉类低于1%时没有掺假的实际意义，本方法采用样品CP值与纯马肉CP值之差小于7作为肉制品掺假判定标准。必须强调的是，作为判定参照的纯马肉DNA的提取必须与样品DNA的提取同步进行，这样可避免不同批次的操作误差，结果才具有可比性。

本研究对市售肉制品的抽查结果未发现有马源性成分，这可能与本研究抽查的样品数量不足，地域局限有关；也与我国的饮食习惯和马匹饲养情况密切有关。本次抽查的进口牛肉产自澳大利亚，为整块肉，掺假可能性极小。

[1] Ballin N Z，Vogensen F K，Karlsson A H. Species determination：can we detect and quantify meat adulteration?[J].Meat Science，2009，83（2）：165-174.

[2] Matsunaga T，Chikuni K，Tanabe R，et al. A quick and simple method for the identifi cation of meat species and meat products by PCR assay[J].Meat Science，1999，51（2）：143-148.

[3] Chisholm J，Conyers C，Booth C，et al. The detection of horse and donkey using real-time PCR[J].Meat Science，2005，70（4）：727-732.

[4] 李林，徐江涛，张永强，等. PCR方法鉴别肉骨粉中的动物成份种类[J]. 中国动物检疫，2004，21（4）：29-31.

[5] Tanabe S，Hase M，Yano O T，et al. A real-time quantitative PCR detection method for pork，chicken，beef，mutton，and horse fl esh in foods [J].Biosci Biotech Biochem，2007，71（12）：3131-3135.

[6] 何玮玲，黄明，张驰. 食品中肉类成分种属鉴别技术研究进展[J].食品科学，2012，33（3）：304-307.

[7] 李生茂，徐祥，梁华平，等.锁核酸研究进展[J].生理科学进展，2003，34（4）：319-323.

[8] 韦信贤，童桂香，谢宗升，等. TaqMan—LNA探针荧光定量PCR快速检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒[J]. 南方农业学报，2011，42（12）：1545-1549.

[9] 王清，伦立民，王丽华，等. Taqman锁核酸探针实时荧光定

量PCR检测乙型肝炎病毒DNA[C].//第七届全国医学生物化学与分子生物学和第四届全国临床应用生物化学与分子生物学联合学术研讨会暨医学生化分会会员代表大会论文集，青岛：中国生物化学与分子生物学会医学生物化学与分子生物学分会，中国生物化学与分子生物学会临床应用生物化学与分子生物学分会.2011：2-22.

[10] 秦智峰，刘建利，卢体康，等.基于锁核酸探针的双层荧光实时RT-PCR检测方法鉴别新城疫中强毒株和弱毒株[J].中国预防兽医学报，2012，34（9）：719-723.

[11] Letertre C，Perelle S，Dilasser F，et al. Evaluation of the performance of LNA and MGB probes in 5’-nuclease PCR assay[J].Molecular and Cellular Probes，17（6）：307-311.

[12] 汪红梅，林丽清，翁少煌，等. 基于锁核酸探针的传感器用于BCR/ABL融合基因检测的研究[J]. 电化学，2011，17（2）：180-185.

[13] 江沽 ，丁渭 ，陈华云，等. 锁核酸探针实时荧光定量PCR检测HB基因变异[J]. 广东医学，2011，32（1）：70-73.

[14] 山东省农业管理干部学院，山东省标准化研究院.DB 37/T 1020-2008 肉类制品中鸡肉、牛肉、猪肉和马肉成分PCR快速检测方法[S].北京：中国标准出版社，2008.

[15] 李爱民，宋华宾，郭文有，等. 羧化胶乳凝集抑制试验快速鉴别牛肉和马肉的研究[J].兽医大学学报，1991，11（3）：204-208.

[16] 郑明光，张国利，周志江，等. 聚合酶链反应（PCR）鉴定马肉方法的建立及应用[J].肉品卫生，1997（7）：6-8.

[17] 李楠，王佳慧，沈青，等.肉制品中马源性成分实时荧光PCR检测方法的建立[J].卫生研究，2013，42（6）：982-986.

[18] 何玮玲，张驰，杨静，等.食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法[J].中国农业科学，2012，45（9）：1873-1880.

（责任编辑：胡藕祥）

Development of a Taqman-LNA PCR Assay for Rapid Detection of Horse-Derived Ingredients in Meat Products

Xu Rusu，Zhou Guangbiao，Duan Jianfa，Su Jianhui，Wei Shuan，Chen Guanwu
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong 515031）

[Objective] To develop a Taqman-LNA PCR assay for rapid detection of horse-derived ingredients in meat products. [Method] A Taqman-LNA PCR was developed for rapid detection of horse-derived ingredients in meat products，using the horse-specific primers and Taqman-LNA probe designed according to the conservative domain gene sequences of horse，and evaluated for its sensibility，specificity and reproducibility. [Results] The method was sensitive with detecting limit of 1.4pg horse DNA and was specific without cross-reaction with pork，beef，mutton，deer，donkey，rabbit，chicken，duck，goose and shrimp. The repeatability test showed that the coeffi cient of variation of intra-assay and inter-assay was less than 2%. The method was used to detect meat products mixed with horse fl esh，obtaining the expected results. [Conclusion] The established Taqman-LNA PCR possessed high sensibility，good specifi city and excellent reproducibility，and was fi t for rapid detection of horse-derived ingredients in meat products.

horse-derived ingredients；locked nucleic acid probe；real-time fluorescence quantitative PCR；meat product

TS 207.3

A

1005-944X（2015）07-0062-05

广东检验检疫局科研课题（2014GDK24）

周广彪