生物活性多肽序列鉴定方法的研究

徐海红，林文珍，李锡安，金赢凯，钱慧佶，程志才，卢飞，张少辉b

（1.上海交通大学a.农业与生物学院；b.陆伯勋食品安全研究中心，上海200240；2.浙江熊猫乳业集团股份有限公司,浙江温州325800）

0 引言

鉴定生物活性肽所用的方法通常以某种生物活性为导向，多次分离鉴定得到活性强的部分，最终鉴定多肽，如Cristian De Gobba等人[1]鉴定来源于羊奶中的的氧化生物活性肽。然而，该策略会在分离过程中造成损失，忽略低浓度的活性物质。特别是，酸奶在发酵过程中产生的多肽来源于不同的牛奶蛋白前体[2]，它们间的相对含量之比相差很大，导致某些多肽很难被鉴定得到。

因此，为了得到尽可能多的生物活性物质，本文通过简单的前处理，用模拟胃肠道消化处理发酵乳，保证得到的肽具有一定的抵制水解的能力，再用超高效液相-质谱仪分析，以期得到更丰富、浓度相对较低的多肽物质。

1 实验

1.1 材料

脱脂奶粉，瑞士乳杆菌CICC6024，胃蛋白酶，胰酶，3 ku超滤管，Sep-Pack@C18（50 mg吸附剂）。

1.2 设备

BJ-2CD超净工作台，LRH-250F生化培养箱，GL-22M高速冷冻离心机，ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，G136T型高压灭菌锅，RO15纯水系统，低温冰箱。

1.3 方法

1.3.1 样品的准备

将活化后的菌种瑞士乳杆菌（CICC6024）发酵剂以质量分数为2%的量接种到质量浓度为120 g/L的灭菌脱脂乳中培养，温度37℃，培养时间7 h，获得发酵乳。将发酵乳装入离心管中低温离心（9 000 r/min，4℃）30 min。离心后弃沉淀，取上清液，并将上清液倒入超滤管中，超滤条件：4 800 r/min，4℃，30 min，离心后超滤液备用。

在固相萃取（SPE）前，取超滤液用ddH2O稀释50倍，备用。固相萃取条件根据Sergio Català-Clariana等人[3]方法稍作修改，固相萃取柱先用乙醇（2 mL）和水（2 mL）活化。上样（2 mL）后，用400 μL溶液（体积比为80:20(甲醇:水)和体积分数为0.1%的甲酸）将吸附着的物质洗脱下来。在上述所有步骤中，流速大约保持在1 mL/min。洗脱液先用氮吹仪在室温条件下吹至约5～6 mL后，真空冷冻干燥成粉末，于-80℃下储存备用。

取冻干后粉末样品进行胃肠道消化模拟实验，主要步骤按照J.A.Gómez-Ruiz等人[4]的方法，并根据Quirós A等人[5]的方法修改而来。具体方法：取1.5 mg样品粉末溶于1.5 mL ddH2O中，在样品（浓度为1 mg/mL）中加入胃蛋白酶(酶：底物=1:50，质量比）后，将pH调至2.0，37℃水浴90 min。随后，将水解产物的pH调至7.5，加入胰酶（酶∶底物=1∶25，质量比），37℃水浴150 min。最后，用95℃水浴5 min使酶失活停止反应。将样品真空冷冻干燥，存储于-80℃备用。

1.3.2 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用分析

（1）样品的准备

将1.3.1中得到的样品溶于100 μ L的ddH2O中，离心后吸取上清液置于样品瓶，离心条件：12 000 r/min，10 min，置于-4 ℃，备用。

（2）液相色谱条件

仪器为Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，色谱柱规格为CSH C18色谱柱，流动相A液为ddH2O，流动相B液为乙腈溶液，流速为0.4 mL/min，温度为45℃，紫外检测波长为220 nm，进样量为5 μL，梯度条件为0～2.5 min保持99%A液，1%B液；2.5～5 min，B液从1%上升至5%，A液从99%下调至95%；5～10 min，B液从5%上升至10%，A液从95%下调至90%；10～17 min，B液从10%上升至25%，A液从90%下调至75%；17～22 min，B液从25%上升至40%，A液从75%下调至60%；22～27 min，B液从40%上升至80%，A液从60%下调至20%；27～29 min，B液从80%上升至100%，A液从20%下调至0%，并保持2 min；31～31.5 min，B液从100%下调至5%，A液从0%上升至95%；31.5～32 min，B液从5%下调至1%，A液从95%上升至99%；32～34 min，保持99%A液，1%B液。

（3）质谱条件

离子方式为ES+，质量范围为50～2000 m/z；毛细管电压（Capillary）为3.0 kV；采样锥为35.0 V；离子源温度为105℃；去溶剂温度为350℃；锥孔气流量为50.0 L/h；去溶剂气流为：600.0 L/Hr；碰撞能量：6.0 eV；碰撞气流：0.6 mL/min；扫描时间：0.26 sec；内扫描时间：0.02 sec。

1.3.3 多肽序列的鉴定方法

（1）牛奶来源蛋白氨基酸序列库的建立

蛋白氨基酸序列通过BIOPEP(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)以及《食品蛋白质——结构、性质、功能》[6]搜索补充完成，包括α s1-酪蛋白（ID：1086-1089，变体A-D），α s2-酪蛋白（ID：1090，变体 A1），β-酪蛋白（ID：1097-1103，变体A1-A3，B，C，E，F），κ -酪蛋白（ID：1117，变体A）,α -乳白蛋白（ID：1115，变体B），β-乳球蛋白（ID：1116，变体 A），乳铁蛋白（ID：1236），血清白蛋白（ID：1729）。将得到的蛋白氨基酸序列建成一个数据库。

（2）氨基酸序列质量的匹对

建立匹配程序，将UPLC-MS分析得到的相对分子质量，在牛奶蛋白的氨基酸序列数据库中进行搜索，得到预测多肽序列。该匹配程序通过JAVA程序和MySQL数据库实现，具体实现的要求：输入由UPLC-MS得到的质量，与已建立的数据库中氨基酸序列匹对，输出相对分子质量误差在±0.01Da内的多肽序列、该序列的相对分子质量以及该序列的具体蛋白来源。

（3）多肽序列的验证

通过Biolynx软件，将1.3.3（2）中预测得到多肽序列的理论二级质谱图与MS/MS得到的实际二级质谱图对比分析，软件通过二级质谱图中的离子碎片峰的匹配情况，根据计算结果，确认预测多肽序列。

1.4 数据处理与分析

用Masslynx软件处理质谱所得数据，提取色谱峰；匹配程序用JAVA程序和MySQL数据库编写；最后通过Biolynx软件计算验证。

2 结果与讨论

2.1 超高效液相色谱-质谱分析

本实验对发酵乳粗分离物经消化处理后进行了超高效液相色谱-质谱分析。图1为消化处理后产物的液相色谱图，根据本实验的处理方法，共得到1025种低分子量化合物，证实了经瑞士乳杆菌发酵得到的发酵产物中物质的复杂性以及质谱检测器优越的灵敏度和分离性。

Pradeep B.Kunda等人[7]研究了一种商业化的抗高血压功能性酸奶，该酸奶由多种特殊菌种作为发酵剂发酵而成，样品经C18和STX两种萃取小柱前处理后，用μLC-TOF-MS检测，分别得到1544和1676种低分子量化合物。Sergio Català-Clariana等人[8]用CE-MS检测婴儿配方奶粉中的生物活性物质，用三种不同的萃取小柱前处理以期得到数量最全的低分子物质，最终鉴定得到91种低分子物质。因为以前这些研究多采用多种发酵菌种的混合发酵，因此得到的低分子量产物比较多。而本实验采用单一的瑞士乳杆菌发酵，然后在模拟人体内的消化条件、经过完全消化处理，所以得到的低分子量产物比相对少一些。考虑到任何发酵产物中的生物活性物质和非生物活性物质均有可能在动物体内被进一步消化后吸收利用。所以本实验对发酵产物在分析前模拟人体内消化条件进行了完全消化预处理。对于生物活性物质如果在动物体内被消化，可能丧失其生物活性；也可能是体外测定得到的生物活性物质在人体内被消化降解为更小分子量的生物活性物质，被消化吸收后发挥其生物活性，也就是体外得到的生物活性物质存在核心片段，在动物体内经过消化释放出来，被吸收后发挥其生物活性。

本实验在UPLC-MS分析前，对发酵乳粗提物进行胃肠道消化模拟实验，因此最终得到的多肽序列对消化酶有良好的耐受性，在一定程度上能抵抗其水解作用，才有可能被吸收利用发挥其生物活性作用。Zhou J等人[9]研究发现，生物活性多肽QEPVL在经过消化处理后，大部分被消化成QEPV，并且其消化产物QEPV仍具有几乎完全相同的生物活性。María del Mar Contreras等人[10]对酪蛋白来源的六种多肽进行了模拟胃肠道消化实验，包括三种抗高血压肽，结果六种多肽均有不同程度的水解，活性也发生了不同的变化。如RYLGY依然保持着较高的ACE抑制活性，而FVAPFPEV的ACE抑制活性却有了很大程度的降低。不管多肽在实验前后的序列、活性如何发生变化，对人体而言，只有经过胃肠道的消化分解才有可能被人体消化吸收，从而发挥其活性。因此，本方法最终得到的多肽序列，在一定程度上能抵制消化酶的水解，有进入机体发挥其生物活性作用的可能性。

2.2 氨基酸序列质量的匹对

以α s1-酪蛋白（ID：1087，变体B）为例，通过程序匹对，得到来源于该蛋白质序列的可能多肽序列共55条，具体序列如表1所示。

2.3 多肽序列的验证

本方法将预测得到的可能多肽序列经Biolynx验证，最终得到牛乳蛋白来源多肽共118条。其中，α s1-酪蛋白、α s2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白来源的多肽序列分别为8，5，21，7，5，11，44，17条，具体分布见表2。由表2可知，得到的多肽大多为3～6个氨基酸组成。经胃消化模拟模拟实验后鉴定得到的多肽序列，多为低分子量的小肽，具有易被吸收的特点。Sadat-Mekmene L等人[11]研究发现，细胞膜上有可运输寡肽的转运体，主要运输3～6个氨基酸残基的多肽，使多肽进入细胞质发挥其活性作用，同时需要ATP水解为肽转运提供能量。

以α s1-酪蛋白（ID：1087，变体B）为例，根据本文方法对预测得到序列逐一分析，得到α s1-酪蛋白来源的多肽序列共8条，具体如表3所示。如质核比为615.37 u的物质，出峰时间为6.63 min，程序推测序列为LEQLL，提取质荷比为615.37 u的质量色谱图及其一级质谱图，如图2所示，将其质谱图导入Biolynx，由图3、4可知，根据az，by断裂的情况，发现该有6个碎片离子峰与LEQLL的实际二级质谱图相吻合，经过Biolynx软件分析计算，质荷比615.37 u的序列片段证实为LEQLL，与α s1-酪蛋白的95-99残基序列对应。再如，质荷比为544.38 u的序列物质，程序推测序列为RLKK，提取质荷比为544.38 u的质量色谱图及其一级质谱图，如图5所示。同理，根据az，by断裂的情况以及图6、图7，未发现与RLKK实际断裂相吻合的碎片离子峰，经过Biolynx软件分析计算，可证实质荷比544.38 u的序列片段不是RLKK。

表1 预测得到来源于αs1-酪蛋白（ID：1087，变体B）的可能多肽序列

表2 瑞士乳杆菌发酵乳粗分离物经消化处理后的产物中多肽的分布

表3 αs1-酪蛋白来源多肽的鉴定

其中，实验中证实已被发现的生物活性多肽GS和SG，它们都具有较高的抑制血管紧张素转化酶活性[12]，文中测定GS和SG的IC50分别为3800和8 500 μmol/L。Jose Angel Gomez-Ruiz等人[18]研究了多种西班牙奶酪，具体筛选了分子量＜1 000 u的混合物，并用HPLC-MS/MS和离线MS/MS具体分析其中成分，从一种Cabrales奶酪中分离得到了多肽MPL，并研究了其抑制血管紧张素转化酶活性，发现活性不显著。此外，鉴定得到的其它αs1-酪蛋白来源多肽序列也分别有被报道过。

除αs1-酪蛋白来源外，还有大量经验证具有生物活性的、其他乳蛋白来源的生物活性多肽，如具有ACE抑制活性的FPIIV[20]，来源于β-酪蛋白的第205～209位残基；具有抗菌活性的KKISQ[21]，来源于αs2-酪蛋白的第180～184位残基等。此外，通过本研究建立的方法，还获得了一系列新的多肽序列，关于这些新多肽序列的活性有待进一步深入研究。

图2 质荷比为615.37 u的质量色谱图及质谱图

图3 质荷比为615.37 u的片段的二级质谱匹对

图4 质荷比为615.37u的预测多肽az，by断裂情况

图5 质荷比为544.38 u的质量色谱图及质谱图

图6 质荷比为615.37 u的片段的二级质谱匹对

图7 质荷比为615.37 u的预测多肽az，by断裂情况

3 结束语

本文对发酵乳进行了有效的前处理后，进行胃肠道消化模拟实验，保证尽可能多的得到消化产物中的多肽，特别是浓度低的多肽，并且得到的多肽序列一定程度上具有抵抗水解的作用，更利于人体吸收并发挥其生物活性。同时，还建立了一种通过分子量匹配得到预测序列，通过Biolynx软件计算验证预测多肽序列的方法。通过这种方法鉴定得到牛奶蛋白来源多肽共118条，除大量已经被报道过的生物活性肽外，还得到了一些未被前人报道过的多肽，为后续将研究这些新发现的多肽是否具有生物活性及其应用奠定了基础。同时为研究探索其他来源的生物活性物质提供了有效的方法。

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